张旭彤，王孝庆，王中苏，张英，曹红，李军

（温州医科大学附属第二医院 麻醉科，浙江 温州 325027）

姜黄素抑制β淀粉样蛋白致小胶质瘤细胞神经炎症反应

张旭彤，王孝庆，王中苏，张英，曹红，李军

（温州医科大学附属第二医院 麻醉科，浙江 温州 325027）

目的:采用β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）致小鼠小胶质瘤细胞（BV2细胞）炎症建立阿尔茨海默病（AD）模型，观察高迁移率族蛋白1（HMGB1）与糖基化终末产物受体（RAGE）介导炎症反应的关系，并探讨姜黄素（Cur）对BV2细胞活力、HMGB1、RAGE、IL-1β、TNF-α、NF-κB表达的影响。方法:将对数生长期的BV2细胞分为4组。对照组:不做任何处理；Aβ25-35模型组:40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h；Aβ25-35+RAGE受体阻断组:抗RAGE抗体10 μmol/L预处理1 h后，加入40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h；Aβ25-35+Cur治疗组:姜黄素10 μmol/L预处理1 h后，加入40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h。孵育24 h后行细胞形态学观察，CCK8检测细胞活性，Western blot法检测细胞HMGB1、NF-κB、RAGE蛋白的表达情况，ELISA法检测上清液HMGB1、IL-1β、TNF-α的含量。结果:与对照组相比，Aβ25-35模型组、Aβ25-35+RAGE受体阻断组细胞活力明显下降，胞内HMGB1表达明显升高（P＜0.05），总NF-κB表达增加（P＜0.05），上清液中IL-1β和TNF-α含量升高（P＜0.05）。与Aβ25-35模型组、Aβ25-35+RAGE受体阻断组相比，Aβ25-35+Cur治疗组细胞内HMGB1、RAGE、NF-κB表达明显下降（P＜0.05），上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量明显下降（P＜0.05）。结论:姜黄素可减轻Aβ25-35引起的BV2细胞炎症反应，其机制与抑制HMGB1表达及核外释放、抑制NF-κB通路有关，与RAGE表达下调部分相关。

阿尔茨海默病；姜黄素；淀粉样β蛋白；BV2细胞；高迁移率族蛋白质类；糖基化终末产物受体

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一进行性认知障碍和记忆力损害的中枢神经退行性疾病。在美国，AD已成为第六大致死性疾病，在65岁以上的人群中为第五大致死性疾病[1]。高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是存在于真核细胞核内的非组蛋白染色体结合蛋白，可直接促进炎症介质释放，部分受糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end product，RAGE）调控。研究发现，AD患者脑组织HMGBl水平增高，能抑制β淀粉样蛋白（amyloid beta-protein，Aβ）的清除并加强Aβ的毒性作用[2]。姜黄素（Curcumin）是从姜黄的根茎中提取出来的一种脂溶性酚类色素，具有抗炎、抗氧化、抗斑块、清除氧自由基等多种药理作用。前期研究[3]发现，姜黄素可下调HMGB1表达及抑制HMGB1的核外释放，从而减轻Aβ25-35引起的PC12细胞毒性。本研究采用高度纯化的BV2细胞株作为体外小胶质瘤细胞模型，用Aβ25-35诱导活化BV2细胞建立AD炎症模型，探讨HMGB1、RAGE在AD中的重要性及姜黄素的抗炎机制，为姜黄素用于AD治疗提供实验基础和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 BV2细胞株:购自中国医学科学院基础医学细胞中心。

1.1.2 药物和试剂:Aβ25-35（A4559）、姜黄素（C1386）购于美国Sigma公司；DMEM培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司；CCK8检测试剂购于日本同仁化学研究所；多克隆抗RAGE抗体（af1179）、小鼠HMGB1、IL-1β、TNF-α ELISA检测试剂盒购于美国R&D公司；HMGB1抗体（ab18256）、RAGE抗体（ab3611）、NF-κB抗体（ab7970）购于美国Abcam公司；小鼠多克隆抗β-actin抗体（ap0060）购自上海Bioworld公司。

1.2 方法

1.2.1 试剂配制:Aβ25-35配成终浓度为500 μmol/L的溶液，分装后-20 ℃保存，使用前提早7 d置于37 ℃水浴箱中孵育，即为“老化”状态；姜黄素用DMSO溶解，配成终浓度为20 mmol/L的溶液，DMSO终浓度不超过0.1%，分装后-20 ℃保存。

1.2.2 BV2细胞培养:BV2细胞培养于DMEM培养基（含5%胎牛血清、100 μg/mL青霉素以及100 μg/mL链霉素），按1×104个细胞/mL密度接种到培养瓶，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，每2 d换液1次，BV2细胞为半贴壁生长，细胞汇集至70%～80%时，按1∶3或1∶4传代，传代6～7次后，多数细胞转为贴壁生长，取第10～第20代细胞进行实验。

1.2.3 细胞分组:将对数期生长的BV2细胞分为4组。对照组:不做任何处理；Aβ25-35模型组: 40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h；Aβ25-35+RAGE受体阻断组:抗RAGE抗体10 μmol/L预处理1 h后，加入40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h；Aβ25-35+Cur治疗组:姜黄素10 μmol/L预处理1 h后，加入40 μmol/L Aβ25-35刺激24 h。24 h后，收集细胞进行后续实验。

1.2.4 CCK8法测细胞活力:取对数生长期的BV2细胞，经胰酶消化后，吹打成单细胞悬液，将各组细胞按5×103个细胞/100 μL的密度接种于96孔板上，边缘孔用无菌PBS填充，防止液体蒸发。16～24 h后，细胞单层铺满孔底，小心吸去孔内培养液，换液，各组加入不同浓度梯度的药物。孵育24 h后，每孔加入10 μL的CCK溶液，在培养箱内孵育1 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。细胞活力=（各处理组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）。

1.2.5 细胞形态学观察:各组细胞孵育24 h后，置于倒置显微镜上观察，比较各组细胞密度、生长状态和突起情况。

1.2.6 Western blot法检测各组细胞HMGB1、RAGE、NF-κB表达:按照Bradford试剂盒及文献[3]的方法测定。抗体浓度分别为:兔抗HMGB1抗体1∶1 000，兔抗RAGE抗体1∶1 000，兔抗NF-κB抗体1∶2 000，小鼠多克隆抗β-actin抗体1∶1 000，HRP标记的羊抗兔IgG抗体1∶5 000。用AlphaEase FC软件分析条带光密度。用Quantityone 4.6.2图像分析软件分析目的蛋白、内参蛋白的平均光密度值，作半定量比值测定分析。

1.2.7 ELISA法测定上清液HMGB1、IL-1β、TNF-α含量:收集细胞上清液200 μL，按照小鼠HMGB1、IL-1β、TNF-α ELISA检测试剂盒说明书处理，以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上查出相应HMGB1、IL-1β、TNF-α含量。

1.3 统计学处理方法 应用SPSS16.0及GraphPad Prism5统计学软件进行统计分析并作图。计量数据用±s表示，用Shapiro-Wilk法行正态性检验，用Leven法行方差齐性检验，多组计量资料比较采用单因素方差分析，方差齐则组内两两比较采用最小显著差异（LSD）法，否则采用Dunnett’s T3检验，不同浓度Aβ25-35对BV2细胞不同作用时间点存活率的影响采用重复测量资料的方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Aβ25-35对BV2细胞存活率的影响 在BV2细胞培养基中加入Aβ25-35，细胞活力明显下降。在6、12、24 h细胞存活率随着Aβ25-35浓度增加而降低，而在36 h后，Aβ25-35浓度对细胞存活率影响不大。本实验尽量考虑延长损伤时间，故确定24 h为药物的作用时间点（见表1）。通过计算得出，其半数致死浓度（IC50）为42.1 μmol/L，为此选择Aβ25-35的造模浓度为40 μmol/L。

表1 不同浓度Aβ25-35对BV2细胞不同作用时间点存活率的影响（n=5，±s）

表1 不同浓度Aβ25-35对BV2细胞不同作用时间点存活率的影响（n=5，±s）

与浓度为0时比:aP＜0.05

1.00±0.001.00±0.001.00±0.001.00±0.00 5 0.68±0.10a0.78±0.100.84±0.02a0.95±0.02 100.64±0.12a0.75±0.130.76±0.02a0.95±0.02 200.62±0.12a0.69±0.07a0.71±0.04a0.94±0.03 300.52±0.16a0.59±0.10a0.62±0.05a0.94±0.03 400.43±0.12a0.53±0.11a0.55±0.04a0.92±0.04a浓度（μmol/L）6 h12 h24 h36 h 0

2.2 姜黄素对BV2细胞存活率的影响 不同姜黄素浓度（0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L）作用24 h后BV2细胞存活率分别为（1.00±0.00、0.97±0.05、1.10±0.09、1.10±0.13、0.92±0.09、0.58± 0.03）。20 μmol/L对细胞的毒性明显强于其他各浓度组（P＜0.05），细胞活力下降可达57.8%。因此选择对BV2细胞没有抑制作用的最高姜黄素浓度为10 μmol/L，与阴性对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 倒置显微镜下各组BV2细胞形态学改变 对照组BV2细胞在孵育4 h左右即能贴壁，胞体较小，少量细胞有突起，突起细小（见图1A）；Aβ25-35模型组贴壁速度明显慢于对照组，细胞出现聚集状态，胞体伸出一个或多个树枝状突起，连接周围细胞，突起粗大（见图1B）；Aβ25-35+RAGE受体阻断组和Aβ25-35+ Cur治疗组的细胞胞体肥大，核仁明显，细胞间以突触相连（见图1C-D）。

图1 倒置显微镜下各组BV2细胞形态学改变（×100）

2.4 Western blot法检测结果 与对照组相比，Aβ25-35模型组Aβ25-35活化诱导后，HMGB1、RAGE和NF-κB灰度值明显升高（P＜0.05）。Aβ25-35+RAGE受体阻断组加入RAGE受体阻断剂后，与Aβ25-35模型组相比，HMGB1、RAGE和NF-κB灰度值差异无统计学意义（P＞0.05），但均明显高于对照组（P＜0.05）。与Aβ25-35模型组、Aβ25-35+RAGE受体阻断组相比，Aβ25-35+Cur治疗组HMGB1、RAGE和NF-κB灰度值明显下降（P＜0.05）。见表2。

2.5 ELISA法检测结果 与对照组相比，Aβ25-35模型组在Aβ25-35活化诱导24 h后，上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量明显升高（P＜0.05）。Aβ25-35+ RAGE受体阻断组与Aβ25-35模型组相比TNF-α有所下降（P＜0.05），其余指标差异无统计学意义（P＞0.05）。Aβ25-35+Cur治疗组与Aβ25-35模型组相比，HMGB1、IL-1β、TNF-α明显下降（P＜0.05）；与对照组相比，HMGB1、TNF-α有所升高（P＜0.05），IL-1β变化差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表2 各组细胞活化诱导24 h后HMGB1、RAGE、NF-κB蛋白表达（n=7，±s）

表2 各组细胞活化诱导24 h后HMGB1、RAGE、NF-κB蛋白表达（n=7，±s）

与对照组比:aP＜0.05；与Aβ25-35模型组比:bP＜0.05；与Aβ25-35+RAGE受体阻断组比:cP＜0.05

组别HMGB1RAGENF-κB对照组0.81±0.160.88±0.100.86±0.09 Aβ25-35模型组1.18±0.06a1.16±0.11a1.20±0.15aAβ25-35+RAGE受体阻断组1.14±0.15a1.11±0.16a1.13±0.15aAβ25-35+Cur治疗组0.90±0.14bc0.86±0.10bc0.87±0.20bc

表3 各组细胞活化诱导24 h后上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量比较（n=7，±s，ng/L）

表3 各组细胞活化诱导24 h后上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量比较（n=7，±s，ng/L）

与对照组比:aP＜0.05；与Aβ25-35模型组比:bP＜0.05；与Aβ25-35+RAGE受体阻断组比:cP＜0.05

组别HMGB1IL-1βTNF-α对照组726.4± 65.426.4±4.521.0±4.1aAβ25-35模型组1 393.5±160.0a51.1±8.4a44.4±2.3aAβ25-35+RAGE受体阻断组1 204.5±238.654.7±6.2a35.1±4.3abAβ25-35+Cur治疗组988.2±217.6abc30.1±6.1bc25.2±3.7abc

3 讨论

研究表明，多种因素所致小胶质瘤细胞激活引发的神经炎症反应在AD的发生发展中扮演重要角色。神经炎症反应可引起认知损害、神经细胞β-淀粉样前体蛋白（myloid beta precursor protein，APP）表达和Aβ的沉积[4]。回顾性研究发现，长期服用非甾体抗炎药（non-steroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）能够延缓AD的发生并减轻症状[5]。小胶质瘤细胞介导的中枢神经炎症反应是AD的重要病理标志，在AD中小胶质瘤细胞能通过吞噬作用抑制Aβ沉积和聚集，防止斑块的形成[6]。然而随着疾病的发展，小胶质瘤细胞产生过多的炎症因子、氧化产物，形成恶性循环，最终失去Aβ清除能力，引起神经元的毒性作用，加快疾病进程[7]。因此小胶质瘤细胞的生长状态对加重或预防神经退行性疾病至关重要。

本实验采用的BV2细胞株基本具备了原代小胶质瘤细胞的形态学、表型及各项功能特点，相对较易培养，被国外许多学者所应用。Aβ25-35是Aβ1-42的活性片段，于37 ℃水浴箱孵育5～7 d，即为“聚集”状态。但目前有关BV2细胞与Aβ相互作用的研究鲜见报道。本实验结果显示，在一定时间内，BV2细胞活性随着Aβ25-35浓度增大而减小，但在36 h后无明显变化，可能与培养基中营养物质消耗造成细胞缺乏营养支持有关。故本实验选择24 h为造模时间，造模浓度为40 μmol/L，结果显示，Aβ25-35模型组贴壁速度明显慢于对照组，细胞出现聚集状态，胞体伸出一个或多个树枝状突起，连接周围细胞，证实Aβ25-35具有致神经炎性作用，离体AD炎症细胞模型成功建立。

在大脑中，炎症刺激伴随着HMGB1的释放，后者可进一步促进炎症反应[8]。HMGB1诱导小胶质瘤细胞活化促进炎症反应的潜在机制及细胞信号传导通路尚未明确。研究[9]表明，HMGB1能激活星形胶质细胞，通过RAGE-MAPK/ERK1/2信号通路，引起IκB磷酸化降解而激活NF-κB，促进MMP-9、COX-2、炎症因子等生物活性分子的表达。本研究用老化状态下的Aβ25-35（40 μmol/L，24 h）处理BV2细胞，可增加HMGB1蛋白表达，同时促进细胞外分泌。RAGE属于跨膜蛋白，能结合多种配体，但HMGB1是其亲和力最高的配体。RAGE可介导小胶质细胞神经炎症、Aβ蓄积而损害小鼠学习记忆功能[10]，且可使细胞产生氧化应激或炎症反应，正反馈加强RAGE的表达。本实验采用抗RAGE抗体阻断RAGE，发现HMGB1、RAGE、NF-κB表达与模型组无显著差异，经排除抗体的剂量及作用时间因素，分析出现此结果的原因可能与HMGB1致炎作用是多途径多通路有关，阻断RAGE并不能抑制HMGB1诱导炎症反应，但炎症反应又可导致RAGE表达增加。CHAVAN等[11]得出了相同结果，他们采用脑内注射重组HMGB1后，对RAGE基因敲除大鼠的观察表明HMGB1介导的大鼠记忆损害可以通过RAGE途径。本研究显示姜黄素可抑制HMGB1和RAGE的表达，HMGB1的作用受体RAGE虽是炎症反应的关键之一，但并不是唯一通路。

Aβ能促进小胶质瘤细胞分泌IL-1、IL-6、TNF-α、NO、活性氧（ROS），导致神经元凋亡[12]。激活的小胶质瘤细胞首先释放IL-1β、TNF-α，后者的级联释放损伤神经元，进一步释放IL-6[13]。其中IL-1增加Aβ的生成[14]，TNF-α加重Aβ的沉积，减弱小胶质瘤细胞降解Aβ的能力，抑制Aβ清除。本研究结果表明，Aβ25-35活化诱导BV2细胞后，上清液中IL-1β、TNF-α分泌增多，而姜黄素预处理能抑制NF-κB的表达和IL-1β、TNF-α的分泌，提示姜黄素是一种抗炎药物，能抑制小胶质瘤细胞释放炎症介质。有研究[15]表明，姜黄素的作用机制是通过磷酸化结合蛋白络氨酸磷酸酶2（SHP-2）抑制JAK2/STAT3信号转导通路；也有研究[16]表明，其作用是通过JNK/p38MAPK抑制IκB磷酸化而抑制NF-κB转录。

综上所述，本实验表明姜黄素可减轻Aβ25-35引起的BV2细胞炎症反应，其机制与抑制HMGB1表达及核外释放、抑制NF-κB通路有关，与RAGE表达下调部分相关。

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（本文编辑：丁敏娇）

Curcumin inhibits neuroinfammation mediated by amyloid beta-protein in BV2 cells

ZHANG Xutong,

WANG Xiaoqing, WANG Zhongsu, ZHANG Ying, CAO Hong, LI Jun. Department of Anesthesiology, the Second Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective：To explore the relationship between high mobility group box1 (HMGB1) and inf ammatory response of the receptor for advanced glycation end product (RAGE) with inf ammation model of Alzheimer’s disease (AD) selected Aβ25-35-induced BV2 cells for 24 hours later, to further investigate the effects of curcumin on expression of HMGB1, RAGE, interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α) in Aβ25-35-induced BV2 cells.Methods：Cultured BV2 cells in logarithmic growth phase were divided into 4 groups: control group (group A, non-treament), model Aβ25-35group (group B, 40 μmol/L Aβ25-35, 24 h), Aβ25-35+anti-RAGE antibody group (group C, 10 μmol/L anti-RAGE antibody 1 h before+40 μmol/L Aβ25-35, 24 h) and Aβ25-35+curcumin treatment group (group D, 8 μmol/L curcumin 1 h before+40 μmol/L Aβ25-35, 24 h). The morphological character of BV2 cells was observed 24 hours later and cells viability was examined by CCK8, the level expression of HMGB1, NF-κB, RAGE in cells were detected by western blotting. The level secretion of HMGB1, IL-1β, TNF-α were detected by ELISA 24 hours later.Results：Compared with group A, the cell viability in group B and C were signif cantly declined and the level of HMGB1 protein expression in cells was signif cantly increased (P＜0.05), the expression of total NF-κB were signif cantly increased (P＜0.05), IL-1β and TNF-α in supernatant were signif cantly increased (P＜0.05). Compared with group B and C, the cell viability, the level of HMGB1 and NF-κB protein expression in cells signif cantly declined, HMGB1/IL-1β and TNF-α in supernatant signif cantly declined in group D (P＜0.05).Conclusion：Curcumin may reduce Aβ25-35-induced neuroinfammation in BV2 cells through inhibiting HMGB1 expression/extracellular released and inhibition NF-κB pathway, partly correlated with RAGE expression down-regulatd.

Alzheimer’s disease; curcumin; amyloid beta-protein; BV2 cells; high mobility group proteins; receptor for advanced glycation end product

R614.1

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.002

2016-03-31

国家自然科学基金资助项目（81271204）；浙江省科技厅公益项目（2016C37098）。

张旭彤（1974-），男，浙江温州人，副主任医师，博士。

李军，主任医师，教授，硕士生导师，Email:lijun0068@163.com。