张良，陈文静，郭刚强，孙祥威，叶璐璐，胡畅远，金劲激，沈贤，薛向阳

（1．温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学 微生物学与免疫学教研室 分子病毒与免疫研究所 热带医学研究所，浙江 温州 325035；3.温州医科大学附属第二医院胃肠外科，浙江 温州 325027）

・论 著・

诱导性表达人巨细胞病毒UL138蛋白的胃癌细胞株构建及其效应评价

张良1，陈文静1，郭刚强2，孙祥威1，叶璐璐2，胡畅远1，金劲激1，沈贤3，薛向阳2

（1．温州医科大学附属第一医院 胃肠外科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学 微生物学与免疫学教研室 分子病毒与免疫研究所 热带医学研究所，浙江 温州 325035；3.温州医科大学附属第二医院胃肠外科，浙江 温州 325027）

目的:构建可诱导表达人巨细胞病毒（HCMV）UL138蛋白的稳定遗传胃癌细胞系，并评价UL138对胃癌细胞的生物学效应。方法:将pCMV-tet3G质粒转染BGC-823胃癌细胞，通过G418及荧光素酶活性检测筛选BGCTet-on细胞株。再将含有UL138外源基因的pTRE3G-UL138质粒转染稳定BGCTet-on细胞株，通过G418及潮霉素双抗筛选，获得诱导性表达UL138基因的胃癌细胞（BGC-UL138Tet-on）。强力霉素（DOX）诱导后，采用Western blot验证UL138蛋白表达，采用流式细胞术及CCK8试剂盒检测UL138蛋白表达对胃癌细胞的生长周期及增殖的影响。构建荷瘤裸鼠模型，体内验证UL138蛋白表达对胃癌细胞增殖的影响。结果:成功构建了DOX诱导性表达的、携带UL138基因的BGC-UL138Tet-on稳转细胞株。UL138蛋白表达可显著抑制胃癌细胞增殖；流式细胞术检测显示UL138蛋白表达阻滞BGC-823细胞周期在G1期。荷瘤裸鼠模型体内实验发现，DOX腹腔注射诱导UL138蛋白表达后，BGC-UL138Tet-on移植瘤体积缩小甚至消失。结论:成功构建可诱导表达UL138蛋白的胃癌细胞株，进一步证实HCMV基因UL138的表达可在体内和体外抑制胃癌细胞的增殖，细胞实验提示细胞周期阻断在G1期。

巨细胞病毒；UL138；Tet-on系统；胃肿瘤；基因，肿瘤抑制

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）属于β疱疹病毒科，是人类疱疹病毒中最大的一种病毒，人群普遍感染，其在人群中感染率达到70%～100%[1]。HCMV基因组约230 kb，约含200个开放阅读框（open reading frame，ORF），编码至少22条microRNA[2-5]及一些长链非编码RNA（long non-coding RNAs，LncRNA）[6]。UL138是HCMV潜伏感染相关的基因，定位于UL/b’区的UL133-UL138基因簇[7]。我们前期研究显示，UL138表达于胃癌及癌旁正常组织[8]，但胃癌组织中表达明显下调，尤其在低分化胃癌组织[9]。采用真核质粒过表达可明显抑制胃癌细胞增殖，并促进胃癌细胞凋亡。这些结果提示，UL138是具有抑癌效应的HCMV基因。为进一步评价UL138在胃癌细胞中的生物学效应，本研究利用Tet-on系统，构建诱导性表达UL138基因的胃癌细胞系，进一步明确UL138基因表达对胃癌细胞基本生物学特征的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株:人胃癌细胞株BGC-823购自中科院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.1.2 质粒:含UL138基因的重组pcDNA3.1-UL138质粒由本实验室前期构建；pCMV-tet3G质粒和pTRE3GLuc质粒均购自美国Clontech公司。

1.1.3 细菌:大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

1.1.4 动物:BALB/c裸鼠，雌性，4～5周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证编号: SCXK（沪）2012-0002。所有动物实验均获得温州医科大学伦理委员会以及实验动物委员会批准。

1.1.5 试剂:UL138特异性抗体由本实验室前期制备[10]；1640培养基、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司；trizol试剂及Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；E.Z.N.A.Endo-free Plasmid Mini Kit购自美国OMEGA公司；强力霉素（doxycycline，DOX）和G418（遗传霉素）购自美国Sigma公司；限制性内切酶购自美国Thermo公司；Taq Mix购自天根生化科技（北京）有限公司；ECL发光液购自美国BioRad公司；FITC标记的二抗购自杭州联科生物技术股份有限公司；荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司；流式凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；CCK8检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；逆转录试剂盒购自日本TOYOBO公司。

1.2 方法

1.2.1 可诱导表达UL138蛋白的BGCTet-on3G细胞系（BGC-UL138Tet-on）构建及鉴定:以pcDNA3.1-UL138为模板，前引物为5’-CCGGATATCGCCACCATGGACGAT CTGCCGCT-3’，后引物为5’-CGCGGATCCTTATCACG TGTATTCTTGATGATAA-3’，通过PCR方法获得UL138片段，通过EcoRV和BamHI限制性内切酶插入到pTRE3G（3 431 bp）质粒中，获得TRE-UL138重组质粒。BGC-823细胞在含5% CO2、饱和湿度、37 ℃条件下的培养箱中培养，用含10%胎牛血清的1640培养基培养。根据Clontech公司的Tet-On®Advanced Inducible Gene Expression Systems操作步骤，最终通过G418筛选以及有限稀释法获得转染成功的单克隆BGCTet-on细胞株。将单克隆株转染pTRE3G-Luc质粒，利用荧光素酶活性检测试剂盒检测荧光，选择荧光表达最强的克隆进行后续实验。转染TREUL138质粒到BGCTet-on细胞，在G418和潮霉素的联合筛选下，获得BGC-UL138Tet-on细胞株克隆。将细胞克隆消化铺6孔板，每个克隆铺2个孔，其中1个孔加入DOX 2 μmol，另外1个孔作为对照，继续培养48 h以后，提取细胞RNA，利用UL138特异前向引物（5’-GGCACGACACCTTCAAAC-3’）和特异反向引物（5’-AGACACTTCCTCCCAACG-3’），RT-PCR检测UL138基因转录。PCR产物扩增为200 bp。

1.2.2 DOX最佳诱导浓度筛选:通过上述实验获取诱导效率最高的克隆株培养在6孔板内，每个孔约105个细胞，按照0、100、200、500、1 000 ng/mL的浓度加入DOX，继续培养48 h后，收集细胞蛋白质，并采用Western blot方法验证UL138蛋白表达量。

1.2.3 RNA提取及反转录:将细胞消化离心，加入1 mL trizol试剂，充分吹打，置冰上10 min后，加入200 μL的氯仿，充分震荡混匀，置冰上15 min，在12 000×g 4 ℃下离心20 min，吸取上清，加入等体积的异丙醇，来回震荡混匀，在冰上沉淀20 min，在12 000×g 4 ℃下离心15 min，弃上清，加入1 mL 80%的乙醇，再次沉淀5 min，然后在10 000×g 4 ℃下离心10 min，弃乙醇，在冰上晾干5 min左右，加入无酶水溶解。采用去DNA试剂盒，将RNA中DNA除去，最后根据反转录试剂盒操作说明书，将1 μg的RNA反转录为cDNA，准备PCR鉴定。

1.2.4 Western blot检测:将细胞裂解从而获取细胞总蛋白，在12%的SDS-PAGE中电泳分离，再在转膜缓冲液中将蛋白转至PVDF膜上，在37 ℃含5%脱脂奶粉的TBST中封闭2 h，再孵育一抗，UL138兔抗（1∶10 000，实验室制备）和GAPDH兔抗（1∶1 000，杭州贤至生物科技有限公司），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，HRP标记的羊抗兔二抗在室温结合1.5 h后，用ECL发光液标记。

1.2.5 免疫荧光检测:细胞消化爬片，6 h以后加入调整DOX浓度至200 ng/mL，诱导48 h后，细胞爬片用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次，再用0.3%的曲拉通打孔10 min，PBS洗3次，然后用含10% FBS的培养基37 ℃下封闭2 h，更换培养基，加UL138兔抗（1∶1 000）孵育1 h。PBS洗3次，用FITC标记的羊抗兔二抗在37 ℃下避光孵育1 h。再用PBS洗3次，加入DAPI染核，37 ℃孵育10 min，PBS洗3次，最后滴加抗荧光淬灭剂封片。

1.2.6 流式细胞术:将细胞消化铺至6孔板，待细胞贴壁后将细胞分为2组，No DOX组，即不加DOX；DOX组，加入DOX 400 ng/mL，48 h后将细胞用PBS洗2次，消化，控制细胞浓度在1×106/mL左右，1 000 r/min离心3 min，PBS洗1次，然后将细胞用0.4%多聚甲醛固定10 min，再用PBS洗1次，动作轻柔，再根据FITC凋亡试剂盒说明书，加入PI染料，染色，上机检测细胞周期。

1.2.7 细胞相对存活率检测:将BGC-823细胞和BGC-UL138Tet-on细胞消化，分别铺在96孔板内，每孔2×104个细胞，分别设置DOX组和No DOX组，其中BGC-UL138Tet-on细胞设置400 ng/mL和200 ng/mL的2个DOX诱导浓度，BGC-823细胞200 ng/mL的DOX诱导浓度，设置5个复孔，6 h后按组加入相应的DOX，48 h后，换无血清培养基，并加入CCK8试剂，检测细胞在450 nm波长时的吸光度。根据说明书计算相对存活率。

1.2.8 荷瘤裸鼠模型体内实验:取生长状态相似的健康BALB/c裸鼠共15只，将裸鼠随机分成A、B、C 3组，每组5只。其中A组裸鼠接种BGCTet-on细胞，B组和C组接种BGC-UL138Tet-on细胞株。接种方法为:在裸鼠右背部皮下接种细胞，浓度为2×107个/mL，接种0.1 mL。从接种时间开始算起，第7天测肿瘤大小，第10天开始A组和B组裸鼠腹腔注射500 μg/mL的DOX，连续注射3 d，并在水中加入1 mg/mL DOX喂养，3 d测1次肿瘤大小，用卡尺测量其长（a）和宽（b），并计算体积V（mm3）=ab2/2。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0统计学软件进行数据分析。数据用±s表示，采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BGC-UL138Tet-on细胞的筛选及UL138蛋白表达验证 荧光素酶活性检测发现，经DOX诱导后，BGCTet-on细胞克隆株的荧光素酶活性为2.6×105～5.2× 105，见图1A。为此，进一步将pTRE-UL138重组质粒转染BGCTet-on细胞克隆株，并在潮霉素和G418筛选下，筛选可诱导表达UL138蛋白的BGC-UL138Tet-on细胞株。RT-PCR结果显示，BGC-UL138Tet-on细胞克隆株均可检测到UL138 RNA，见图1B。DOX浓度梯度诱导实验，发现随着DOX浓度增加，UL138蛋白的表达量也随之上升。当没有DOX时，UL138蛋白没有表达，见图1C。进一步利用免疫荧光检测，发现BGCUL138Tet-on细胞在DOX诱导的情况下，UL138蛋白的表达主要定位在细胞质内，其单视野内细胞的表达阳性率约为70%。显微镜下UL138蛋白表达情况，见图1D。在DOX使用情况下，BGC-UL138Tet-on细胞被诱导表达UL138蛋白，而没有DOX时，不表达UL138蛋白。

2.2 BGC-UL138Tet-on细胞UL138基因稳定性分析 为了验证BGC-UL138Tet-on细胞在传代过程中仍然保存有可被DOX诱导UL138表达的能力，我们通过连续传代细胞3次，并在每1代细胞设置DOX组和No DOX组。结果显示，在每次连续传代中，细胞能稳定保持这种可诱导表达能力，见图2。

2.3 UL138蛋白表达对BGC-823细胞增殖及细胞周期的影响 DOX诱导48 h后，BGC-UL138Tet-on细胞出现死亡，而BGCTet-on细胞克隆株以及无DOX诱导下BGCUL138Tet-on细胞生长未见影响，见图3A。CCK8实验显示，DOX诱导48 h之后，BGC-UL138Tet-on细胞的相对生存率显著下降，DOX为200 ng/mL时，BGC-UL138Tet-on相对生存率为（44.97±1.44）%，而BGC-823的相对生存率为（87.95±2.04）%；DOX为400 ng/mL时，相对生存率为（32.36±2.50）%，各组间差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图3B。流式细胞术检测细胞周期发现，No DOX组细胞周期G0/G1、S、G2/M期的细胞数量百分比分别为（55.96±1.50）%、（36.97±1.59）%、（7.26±0.08）%，而DOX组细胞周期G0/G1、S、G2/M期的细胞数量百分比为（64.07± 0.97）%、（27.19±1.01）%、（8.71±0.22）%。当DOX诱导时，BGC-823细胞更多地存在于G1期，见图3C-D。

图1 BGC-UL138Tet-on细胞的筛选及UL138蛋白表达验证

图2 DOX诱导不同代数BGC-UL138Tet-on细胞UL138蛋白表达情况

图3 UL138蛋白表达对BGC-823细胞增殖的影响

2.4 荷瘤裸鼠模型实验 成功构建了裸鼠的荷瘤模型，并且发现了在DOX的诱导下BGC-UL138Tet-on细胞株的移植瘤逐渐减少，而其他2组则没有，DOX是在第10天开始干预，见图4A。在DOX诱导后第21天（接种后第31天），B组BGC-UL138Tet-on的移植瘤裸鼠肿瘤几乎消失。然而，作为对照的A组和C组细胞移植瘤持续增大，见图4B。

图4 荷瘤裸鼠模型实验

3 讨论

自从CRAIG等[11]第1次分离出HCMV距今已经60年左右，既往HCMV感染主要危害集中在单核细胞增多症、先天感染引起胎儿畸形，以及艾滋病（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）和器官移植患者体内HCMV感染[12]，另外HCMV的感染也与系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）等自身免疫系统疾病存在相关性[13-14]。近年来的研究显示，HCMV与恶性胶质瘤细胞[15]、乳腺癌[16]、前列腺癌[17]、结直肠癌[18]等肿瘤的发生发展相关。我们前期的研究也发现HCMV潜伏感染与胃癌相关[19]。

UL138基因位于HCMV基因组UL/b’区的UL133-138基因座内，在临床病毒株中十分保守[20]。UL138作为HCMV对抗宿主细胞防御的病毒基因，能够帮助HCMV顺利进入潜伏感染状态[21]。HCMV感染细胞应激状态诱导UL138蛋白表达[22]。HCMV潜伏过程表达的UL138蛋白定位于高尔基体[23]，可上调细胞TNF受体表达[24]，并能与细胞内MRP1蛋白结合，影响细胞的耐药机制[25]。我们前期的实验结果发现，在胃癌细胞中，UL138可能具有抑癌基因的功能，能封闭HSP70的作用，引起胃癌细胞凋亡[9]。基于这种效应，我们利用Tet-on系统构建可诱导表达UL138蛋白的BGC-823细胞株，进一步评价UL138蛋白对胃癌细胞的生长抑制作用，并在裸鼠体内验证。结果显示，与前期质粒转染结果一致，DOX诱导BGCUL138Tet-on细胞UL138蛋白表达，在体内和体外均可显著抑制胃癌细胞增殖，使细胞周期阻滞在G1期。

Tet-on系统是真核生物体内可控制诱导表达外源性基因的系统，具有稳定、可调控、低噪点、高表达的特点，被广泛使用[26]。白志强等[27]利用Tet-on系统构建了可诱导表达HCMV IE2基因的肝癌细胞系，验证了IE2基因抗凋亡的作用。YAO等[28]基于Tet-on改建的可诱导表达DRD1蛋白细胞株，为神经系统疾病研究提供了重要工具。本研究首次构建了可诱导表达HCMV UL138蛋白的胃癌BGC-823细胞株，具有稳定的遗传特性。在DOX诱导下，UL138蛋白表达量高；在无DOX存在下，UL138几乎不表达。我们能通过调节DOX浓度，从而达到调节细胞内UL138蛋白表达浓度的目的，相比于瞬转UL138的真核表达质粒，Tet-on系统是一种更可靠的实验工具，而且只要低剂量的DOX便可以诱导细胞表达UL138蛋白。因此，在研究UL138蛋白功能时，可明显减少其他因素对实验的干扰。但是，免疫荧光检测的结果发现，DOX诱导下，并非全部的细胞均可高表达目的基因，这提示Tet-on系统用于外源基因功能的研究亦存在一定不足。

关于肿瘤与感染主流的观点是，病原体感染是肿瘤的病因或可促进肿瘤的发生发展。少数研究也发现，有些病原体可溶瘤或抑制肿瘤细胞增殖[29-30]，但迄今尚未见报道有杀瘤或抑瘤效应的病毒基因。本研究证实HCMV的UL138是具有抑制胃癌细胞生长的病毒基因，将是一种潜在胃癌药物开发的切入点。

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（本文编辑：吴昔昔）

Establishment and its impact evaluation of a gastric cancer cell line with inducible expression of human

cytomegalovirus UL138 protein

ZHANG Liang1, CHEN Wenjing1, GUO Gangqiang2, SUN Xiangwei1, YE Lu-

lu2, HU Changyuan1, JIN Jinji1, SHEN Xian3, XUE Xiangyang2. 1.Department of Gastrointestinal Surgery, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Microbiology and Immunology, Institute of Molecular Virology and Immunology, Institute of Tropical Medicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 3.Department of Gastrointestinal Surgery, the Second Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective：To establish a stably inherited gastric cell line with inducible expression of human cytomegalovirus UL138 protein and then to evaluate the biological effect of UL138 protein on gastric cancers (GCs), which will offer a convincing tool for researching the specif c function of UL138 protein impact on GCs.Methods：Transfect pCMV-tet3G plasmids into BGC-823 and then screen for stablely transfected clones BGCTet-onby G418 and luciferase assay. Then transfect the recombinant plasmid pTRE3G-UL138 into the selected clone and screen for stably transfected clones BGC-UL138Tet-onby G418 and hygromycin. Validate the expression of UL138 induced by doxycycline (DOX) by western blot. Besides, detect the growth impact of UL138 protein on GCs by f ow cytometry and CCK8 test. Establish GC xenograft nude mice models and verify the GC inhibition function of UL138 protein in vivo.Results：Gastric cancer cell line BGC-UL138Tet-onwith DOX inducible expression of human cytomegalovirus UL138 protein was successfully established. Expression of UL138 protein inhibited proliferation of GC cells distinctly. Flow cytometry test indicated UL138 protein could block GC cell cycle at G1phase. The data of GC xenograft nude mice models further demonstrated that the BGC-UL138Tet-onxenografts were decreased, and evendisappeared, when UL138 expression was induced by DOX intraperitoneal injection.Conclusion：We successfully established a specif c GC cell line with inducible expression of human cytomegalovirus UL138 protein and then we found HCMV UL138 gene could inhibit proliferation of GC cells in vitro and in vivo and block its cell cycle.

cytomegalovirus; UL138; Tet-on system; gastric neoplasms; genes, tumor suppressor

R373.9

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.02.001

2016-05-31

国家自然科学基金资助项目（81472308，81001343，31470891）；温州市科技局科研基金资助项目（Y2015 0054，Y20150057）。

张良（1991-），男，浙江温州人，硕士生。

薛向阳，副教授，Email:wzxxy001@163.com。