谭宇 罗薇 曹海峰 房兵 杨秩

ADAM10对小鼠颅颌面膜内成骨的影响

谭宇 罗薇 曹海峰 房兵 杨秩

目的探索解聚素样金属蛋白酶10（ADAM10）对小鼠颅颌面骨骼膜内成骨的影响。方法应用组织免疫荧光染色及蛋白免疫印迹研究ADAM10在小鼠颅颌面骨中的不同时间点、不同部位的表达水平。通过cre-loxp技术在胚胎小鼠颅颌面骨骼中特异性敲除ADAM10基因，应用体视显微镜观察基因敲除小鼠的颅颌面畸形，X线检查、von Kossa染色检测基因敲除小鼠骨钙化情况，双标免疫荧光观察基因敲除小鼠骨组织细胞增殖、分化、凋亡能力的改变。结果组织免疫荧光染色显示小鼠上、下颌骨成骨活跃区ADAM10表达明显，同时蛋白免疫印迹结果证实，ADAM10在小鼠出生前后表达高，成年后表达明显降低。大体观察基因敲除小鼠身体体型较小，颅颌面畸形表现为面中部发育不足，上下颌骨发育不足，颅顶塌陷。X线片检测及von Kosaa染色显示基因敲除小鼠全身骨骼密度减低，骨组织形成较弱。免疫荧光检测发现ADAM10基因敲除小鼠下颌骨细胞增殖、成骨分化能力减低、凋亡增加。结论ADAM10广泛表达于小鼠膜内成骨区域，可能通过影响骨组织细胞增殖、分化及凋亡来调控小鼠颅面部膜内成骨过程。

解聚素样金属蛋白酶10颅颌面骨骼膜内成骨

神经嵴干细胞是一群从神经管侧面分化而来的多潜能分化细胞[1]。神经嵴干细胞在颅颌面复合体形成过程中扮演重要角色，可分化为成软骨细胞、成骨细胞和成牙本质细胞。颅颌面复合体大部分组织主要是通过膜内成骨或软骨内成骨途径形成[2]。其中，颅底和下颌骨髁突是通过软骨内成骨途径形成；大部分颅颌面骨骼，包括上下颌骨都是通过膜内成骨方式发育形成的。膜内成骨开始于间充质干细胞聚集，细胞分化为定向成骨细胞前体，最终分化为成熟成骨细胞，并形成骨质[3]。既往研究发现，颅颌面骨骼膜内成骨过程，受转化因子、生长因子、细胞因子和细胞外机制等多途径调控，但颅颌面骨骼发育的机制仍不清楚。

解聚素样金属蛋白酶10（A disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）在神经系统、心血管发育，以及肿瘤、阿茨海默症等发生中作用重大[4-5]。研究表明，ADAM10在小鼠长骨中显著表达[6]。ADAM10基因全敲除小鼠在胚胎9.5 d死亡，限制了ADAM10在颅颌面骨骼发育中作用的研究。因此，本实验使用ADAM10条件敲除小鼠，以探索ADAM10的功能及其在颅颌面膜内成骨中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6小鼠（上海斯莱克实验动物有限公司），由上海交通大学附属第九人民医院SPF级实验动物中心饲养管理[SYXK(沪)2012-0007]。小鼠发育时间按检到阴栓的当日中午定为胚胎0.5 d。本研究动物实验严格按照《关于善待实验动物的指导性意见》（中华人民共和国科学技术部）标准操作。

1.2 主要试剂与仪器

DNA提取试剂盒［天根生化科技(北京)有限公司］、OCT胶（SAKURA公司，日本）、抗ADAM10抗体（Abcam公司，英国）、抗GAPDH抗体（CST公司，美国）、Hoechst（上海碧云天生物技术有限公司）、BrdU（Sigma公司，美国）、Tunel试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）、驴抗小鼠、驴抗兔荧光二抗（Invitrogen公司，美国）。

冰冻组织切片机（SHINVA公司，中国）、体视显微镜（Cannon公司，日本）、荧光显微镜（Nikon公司，日本）、PCR扩增仪（Roche公司，瑞士）。

1.3Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠的获得

Wnt1基因为颅神经嵴细胞标志性基因。经由Wnt1-Cre小鼠和ADAM10flox/flox小鼠两步交配获得Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠，即表达Wnt1基因的细胞中特异性敲除ADAM10基因的小鼠。第一步，Wnt1-Cre小鼠与ADAM10flox/flox小鼠交配，获得Wnt1-Cre/ADAM10flox/wt小鼠；第二步，Wnt1-Cre/ ADAM10flox/wt小鼠与ADAM10flox/flox小鼠交配，获得Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠。选择雄性Wnt1-Cre/ ADAM10flox/wt小鼠和雌性ADAM10flox/flox小鼠交配，则可获得稳定的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠群。

1.4 条件性基因敲除小鼠基因型的鉴定

剪取待鉴定小鼠鼠尾约2 mm，提取DNA。在长波紫外光下分析DNA条带，Wnt1-Cre小鼠基因鉴定结果为500 bp条带，ADAM10flox/flox小鼠基因鉴定结果为400 bp条带，ADAM10flox/wt小鼠为一条400 bp条带和一条200 bp条带（图1）。

图1 条件性基因敲除小鼠基因型的鉴定Fig.1Genotype identification of conditional knockout mice

1.5 实验动物分组

按基因型鉴定结果，分为颅神经嵴细胞特异性ADAM10条件敲除小鼠，即Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox，以及同窝对照小鼠ADAM10flox/flox两组。

1.6 小鼠骨组织冰冻切片制备

取小鼠置于冰上处死。小鼠剥皮处理，使用1× PBS心包灌注，冲洗至冲出液呈现透明。4%多聚甲醛灌注固定，至小鼠四肢及尾部僵直，固定24～48 h。30%蔗糖梯度脱水，OCT胶包埋小鼠头颅，连续切片（厚度30 μm）。切片置于60℃烘箱30 min，待冷却至室温，-20℃保存。

1.7 免疫蛋白印迹

取E14.5、E17.5、P0、P7及成年小鼠下颌骨骨组织，液氮中研磨后，加入蛋白裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液，测量蛋白浓度。配制免疫蛋白印迹凝胶，提取蛋白样品、电泳、转膜。封闭非特异性蛋白结合位点，加入封闭缓冲液稀释的一抗，4℃孵育24 h，TBST清洗，加入封闭缓冲液稀释的二抗，室温孵育2 h，TBST清洗，显色液显色，胶片显影，将显影胶片扫描后使用分析软件对条带进行灰度分析。重复实验3次，统计分析数据。

1.8 免疫荧光

冰冻切片置于摇床上，PBS清洗，5%BSA+3‰Triton封闭打孔，一抗4℃孵育24 h，PBS清洗，加入二抗及Hoechst，37℃避光2 h，PBS避光清洗。荧光封片剂封片，置于-20℃保存。激光共聚焦显微镜观察并拍摄。

1.9 X线观察

对E15.5小鼠以5.0 kV、6.0 sec条件拍摄小鼠全身X线片。

1.10von Kossa染色

组织玻片PBS清洗，2%硝酸银浸染30～60 min，蒸馏水清洗5 min，5%硫代硫酸钠水溶液处理2 min，自来水清洗5 min，0.1%核固红染液复染1～2 min，蒸馏水清洗5～10 sec，常规脱水透明，中性树脂封片后，置通风橱中干燥。

1.11 统计学分析

所有的数据均独立重复3次以上，采用两样本均数t检验进行组间比较，P＜0.05表示差异具有统计学意义，统计软件为SPSS Statistics 17.0。

2 结果

2.1 ADAM10在下颌骨发育过程中的表达

免疫蛋白印迹结果显示，下颌骨中可见ADAM10表达（图2A），并且ADAM10在胚胎期14.5 d至出生后7 d高表达，成年后表达显著降低（P＜0.05）（图2B）。免疫荧光染色显示，ADAM10在颅颌面骨膜内成骨区域表达明显，如上、下颌骨区域（图2C）。

2.2 ADAM10条件敲除小鼠颅颌面骨骼发育异常

选取E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠与其同窝ADAM10flox/flox对照小鼠，进行颅颌面的大体形态观察对比。结果发现，E15.5的Wnt1-Cre/ ADAM10flox/flox小鼠体型较小，面中部及上、下颌骨发育不足，颅顶塌陷（图3）。

2.3 ADAM10条件敲除小鼠上、下颌骨骨钙化、骨沉积异常

选取E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠与其同窝ADAM10flox/flox对照小鼠的全身X线观察对比发现，Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠骨骼较小、骨密度降低，两组差异显著（图4A、B）。

von Kossa染色观察发现类似结果，E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠上、下颌骨骨形成区域骨小梁紊乱，上、下颌骨黑色染色区域较少，即成骨组织形成较弱，与对照组相比差异显著（图4C、D）。

2.4 ADAM10条件敲除小鼠下颌骨细胞增殖、分化及凋亡异常

通过免疫荧光对Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠及对照组进行成骨分化相关标记物检测发现，E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠在颅颌面的成骨细胞标记物OCN表达降低，成骨分化能力减弱，与对照组相比差异显著（图5A、D）。BrdU标记和免疫荧光检测显示，E15.5的Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠BrdU阳性细胞数目较少，但与对照组无显著差异（图5B、E）。Tunel原位检测试剂盒检测小鼠下颌骨组织的细胞凋亡情况，发现Wnt1-Cre/ADAM10flox/flox小鼠下颌骨凋亡细胞明显增加，与对照组差异显著（图5C、F）。

图2 ADAM10在下颌骨发育过程中的时空表达（*：P＜0.05）Fig.2Expression of ADAM10 in mice during intramembranous ossification(*:P＜0.05)

图3ADAM10条件性基因敲除小鼠颅颌面发育异常Fig.3Conditional knockout of ADAM10 triggered craniofacial dysmorphia

图4 ADAM10条件基因敲除小鼠骨密度、骨钙化降低（*：P＜0.05）Fig.4Reduced maxilla and mandibular calcification in ADAM10 cKO mice(*:P＜0.05)

图5 ADAM10条件基因敲除小鼠下颌骨细胞分化、增殖及凋亡能力的改变（*：P＜0.05）Fig.5Cell proliferation,apoptosis and osteoblast differentiation in ADAM10 cKO mice(*:P＜0.05)

3 讨论

本研究中，我们主要探索ADAM10在小鼠颅颌面骨，特别是下颌骨发育中的作用。结果显示，ADAM10特异性高表达于颅颌面骨骼膜内成骨区域，并且在生长发育不同阶段表达量变化显著。ADAM10条件性敲除小鼠呈现颅颌面骨及软组织发育异常。细胞学研究表明，ADAM10条件性敲除小鼠下颌骨前成骨细胞成骨能力降低、下颌骨区域细胞凋亡增加。表明ADAM10在颅颌面骨骼发育中具有重要作用。

Dallas等[6]在新生小鼠胫骨中发现，ADAM10特异性高表达于关节软骨和骨干骺端。本研究有类似发现，ADAM10在上、下颌骨成骨区域特异性高表达，但在成年小鼠中表达显著降低，提示ADAM10可能参与上、下颌骨膜内成骨过程。

ADAM10功能紊乱可导致多种严重病理结果。Isozaki等[7]研究表明，ADAM10在关节炎关节软骨及癌症组织中高表达。Woods等[8]发现ADAM10相关的细胞外基质流失，可能促进肿瘤细胞的转移和迁移。Pliássova等[9]报道，ADAM10与阿茨海默症发病密切相关。研究表明，ADAM10在中枢神经、心血管系统、小肠及肾皮质等发育中具有重要作用[10-12]。体内实验发现，ADAM10影响破骨细胞功能，造成骨骼异常[13]。

颅颌面的大部分骨组织都是由颅神经嵴细胞通过膜内成骨发育而来[14]。ADAM10全身敲除小鼠在胚胎期第9.5天死亡，限制了颅颌面骨骼发育的相关研究。既往有研究报道使用Wnt1-Cre转基因小鼠探索特定基因在颅神经嵴细胞中的作用[18]。因此，本实验使用Wnt1-Cre转基因小鼠在神经嵴细胞中特异性敲除ADAM10，研究ADAM10在颅颌面骨骼发育中的作用。

本研究中，实验组小鼠上、下颌骨长度及宽度与对照组相比均显著减小。X线检查发现，实验组小鼠骨密度明显降低。von Kossa染色进一步发现，实验组小鼠上、下颌骨膜内成骨区域骨小梁紊乱。这些结果表明，ADAM10在颅颌面骨骼膜内成骨过程中作用重大。

研究证明，ADAM10对多个系统发育中的干细胞增殖及分化，具有不可忽视的调控作用[15-17]。本研究中，我们通过OCN染色发现，ADAM10基因敲除小鼠成骨细胞分化显著降低。然而，细胞成骨分化降低并不能完全解释ADAM10基因敲除小鼠骨骼发育异常。我们进一步研究基因敲除小鼠细胞增殖及凋亡能力的改变，发现基因敲除小鼠下颌骨细胞凋亡显著增加、增殖能力降低。

综上所述，本研究证实ADAM10在小鼠颅颌面骨膜内成骨过程中发挥重要作用。敲除ADAM10会影响细胞成骨向分化、增殖及凋亡，进而造成颅颌面骨发育异常。

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[10]Jones JC,Rustagi S,Dempsey PJ.ADAM proteases and gastroin testinal function[J].Annu Rev Physiol,2016,78:243-276.者，则建议采用鼻唇沟皮瓣进行修复。两种手术方法各有优缺点，临床上需结合患者实际情况，进行综合考虑，并慎重选择。

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（收稿日期：2016年12月21日；修回日期：2016年1月19日）

The Effects of ADAM10 in Craniofacial Intramembranous Ossification of Mice

ObjectiveTo explore the effects of ADAM10 in craniofacial intramembranous ossification of mice.Methods The expression pattern of ADAM10 in mice mandibular was detected by immunofluorescence assay and western blot.Creloxp technique was used to detect the function of ADAM10 in intramembranous ossification areas during craniomaxillofacial development.ADAM10 conditional knock-out mice was evaluated by X-ray and von Kossa staining.The cell proliferation, apoptosis and osteoblast differentiation were detected by immunofluorescence assay.ResultsImmunofluorescence assay revealed that ADAM10 was primarily distributed in the maxillary and mandibular skeletal genesis zones.ADAM10 was abundantly expressed from E14.5 to postnatal day 7(P7)and was significantly decreased during adulthood.On E15.5,the ADAM10 cKO mice exhibited a shorter snout,flatter posterior skull and smaller maxilla and mandible,compared with the control littermates.The X-ray examination and von Kossa staining shown that the ADAM10 cKO embryos exhibited significantly reduced mineral bone deposition in the maxilla and mandible.Immunofluorescence shown that cell proliferation, apoptosis and osteoblast differentiation were impaired in ADAM10 cKO mice.ConclusionADAM10,widely expressed in osteogenesis area of mice,can affect the intramembranous bone formation by regulating cell proliferation,differentiation and apoptosis.

ADAM10;Maxillofacial bone;Intramembranous bone formation

R336

A

1673－0364（2017）01－0013－05

TAN Yu1,LUO Wei2,CAO Haifeng3, FANG Bing3,YANG Zhi3．
1 The Second Dental Center,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Department of Orthodontics,Shanghai Stomatological Hospital,Shanghai 200011,China;3 Department of Oral&Cranio-maxillofacial Science,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:FANG Bing(E-mail:fangbing@sjtu.edu.cn); YANG Zhi(E-mail:yangzhi-9th@hotmail.com).

2016年7月24日；

2016年9月11日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.004

上海市科委面上项目（14ZR1424100）；国家自然科学基金青年项目（81000451）；上海市卫生局青年科研项目（2010y142）；上海市教委优秀青年教师项目；上海市第九人民医院优青项目；上海市卫计委青年项目（20154Y0181）；上海市口腔病防治院面上项目（SSDC-2013-01）。

201900上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔第二门诊部（谭宇）；200001上海市上海市口腔病防治院口腔正畸科（罗薇）；200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颅颌面科正颌正畸中心（曹海峰，房兵，杨秩）。

房兵（E-mail:fangbing@sjtu.edu.cn）；杨秩（E-mail:yangzhi-9th@hotmail.com）。

注：谭宇、罗薇为共同第一作者。