林怀安 余力 王健 张波 郑丹宁 周佳

丹参对3T3-L1细胞成脂分化与增殖的影响

林怀安 余力 王健 张波 郑丹宁 周佳

目的观察丹参对3T3-L1细胞成脂分化和增殖的影响，为丹参应用于自体脂肪移植提供实验依据。方法将含有不同终浓度丹参注射液的完全培养液（0.6 g/L、0.3 g/L、0.15 g/L、0.075 g/L、0.04 g/L、0.02 g/L）分别加入诱导分化的3T3-L1细胞，待细胞分化至成熟脂肪细胞时，利用CCK-8法检测细胞增殖活力；利用油红O染色法、Image-pro plus 6.0软件观察脂肪细胞内脂质的聚积；利用甘油三酯GPO-POD法测定脂肪细胞的脂质含量。结果丹参可促进3T3-L1细胞增殖，且呈一定的时间、剂量依赖关系：加药时间点越早，对3T3-L1细胞增殖的促进作用越大；丹参浓度越大，对3T3-L1细胞增殖的促进作用越大。丹参同时也促进了3T3-L1细胞的成脂分化，增加细胞内脂质的聚积，并呈一定的剂量依赖关系。结论丹参能够促进3T3-L1细胞的成脂分化以及增殖，使成熟脂肪细胞的数量增加。

丹参3T3-L1细胞增殖细胞分化

自体脂肪移植用于软组织的填充与修复重建，具有取材简便、来源丰富、生物相容性良好、无排异反应等优点。临床上各种提高脂肪移植存活率的方法，其结果仍然不尽如人意[1]。

为提高自体脂肪移植的存活率，达到理想的填充结果，针对移植脂肪组织的存活机制进行了大量研究，由脂肪来源干细胞（Adipose derived stromal/ stem cells，ADSC）主导的“脂肪细胞再生”理论，以及加快移植脂肪组织的血运重建，是提高移植脂肪存活率的关键因素[2]。ADSC是脂肪组织特有的前体细胞，其抗缺血、缺氧能力强，能克服移植早期的缺血状态，待血氧充足时，可分化为成熟的脂肪细胞，促进脂肪组织的更新[3]。在脂肪移植术后，促进低分化ADSC增殖，并向成熟的脂肪细胞转化，尽可能地保持脂肪移植组织的体积和重量，从而提高脂肪移植的存活率。

现代药理研究发现，丹参具有扩张血管、改善微循环、防止心肌缺血和心肌梗死等作用，被广泛用于心血管疾病的治疗。研究证实，其活性成分不但可以直接保护内皮细胞，还可以通过增加内皮祖细胞的数量以促进血管内皮的修复[4]。同时，丹参可促进多种细胞的分化增殖[5]。3T3-L1小鼠前脂肪细胞株具有ADSC的生理、生化特性及细胞形态，经诱导可分化为成熟的脂肪细胞，被广泛应用于体外脂肪细胞分化的研究[6]。因此，本实验通过观察不同浓度的丹参对3T3-L1细胞增殖与成脂分化的影响，探讨丹参注射液对ADSC增殖与分化的作用，为进一步的动物实验和临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与器材

小鼠3T3-L1细胞（ATCC细胞库，美国）；丹参注射液（正大青春宝药业有限公司）；DMEM高糖培养基、胎牛血清（Hyclone公司，美国）；0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美国）；1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤、地塞米松、合成人胰岛素、青链霉素（Sigma公司，美国）；细胞增殖/毒性检测试剂盒（同仁化学研究所，日本）；油红O染液、甘油和甘油三酯测试盒（南京建成生物工程研究所）。

超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；恒温CO2培养箱（FormaScientific公司，美国）；倒置相差显微镜（Nikon公司，日本）；100 mm培养皿、离心管（FALCON公司，美国）；Image Pro Plus 6.0软件（Media Cybernetics公司，美国）；酶联免疫检测仪（Thermo公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1细胞培养与分化

将3T3-L1细胞培养于完全培养基（高糖DMEM，含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素），于37℃、5%CO2下培养。细胞生长融合至80%时，以0.25%胰酶消化，1∶4传代。取第5代细胞用于成脂分化，调整细胞密度至2×104cells/L，接种于培养板，待细胞融合48 h后，将培养基更换为含有诱导液A（0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L DEX，10 μg/mL INS）的完全培养基（为诱导分化的第0天）。48 h后，换成含有诱导液B（高糖DMEM，含10 μg/mL INS）的完全培养基（为诱导分化的第2天）。48 h后，再换回不含诱导液的完全培养基，隔2天换液一次。

1.2.2 CCK-8细胞增殖活力分析

将3T3-L1细胞培养于完全培养基，调整细胞密度至2×104cells/L，接种于96孔培养板，每孔100 μL。在诱导分化至第4天、第6天、第8天时，实验组分别加入含有不同终浓度（0.6 g/L、0.3 g/L、0.15 g/L、0.075 g/L、0.04 g/L、0.02 g/L）丹参注射液的完全培养液进行干预。对照组加入不含丹参的完全培养液。隔2天换液一次，各组均设6个复孔。在诱导分化的第9天、第10天、第11天于每孔加入含有10%CCK-8溶液的PBS溶液100 μL，37℃孵育2 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。

本文通过对研究区域生态重建现场调查，获取研究区原始资料和数据，通过分析植物群落特征，结合现场植被样方调查数据，选取合适的评价指标因子，建立一套合理的评价体系，对研究区生态重建效果进行定量评价，从而为矿山生态重建下一步规划设计提供科学依据。

1.2.3 油红O染色

将3T3-L1细胞培养于完全培养基，调整细胞密度至2×104cells/L，接种于6孔培养板，每孔2 mL。第4天，实验组分别加入含有不同终浓度丹参注射液的完全培养液，对照组加入不含丹参的完全培养液。第9天时，PBS溶液冲洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗细胞3次，油红O室温染色15 min，PBS冲洗多余油红O染液3次，镜下观察并拍照，以Image-pro plus 6.0软件分析油红O染色阳性面积。

1.2.4 甘油三酯含量测定

将3T3-L1细胞培养于完全培养基，调整细胞密度至2×104cells/L，接种于24孔培养板，每孔500 μL。第4天，实验组分别加入含有不同终浓度丹参注射液的完全培养液，对照组加入不含丹参的完全培养液。第9天时，每孔加入100 μL含有PMSF终浓度为1 mM的TritionX-100裂解液，裂解30 min。按照甘油三酯测试盒说明书，将裂解好的细胞样本、甘油校准品、蒸馏水各2.5 μL分别加入至96孔板，并设立对照组，各组均设6个复孔，每孔再加入工作液250 μL，混匀后于37℃下孵育10 min，用酶标仪测定510 nm处的吸光度值。同时用BCA蛋白含量试剂盒测定细胞样本的总蛋白浓度，以甘油标准液作出标准曲线，通过标准曲线测出蛋白浓度以校正TG值。

1.2.5 统计学分析

采用SPSS22.0进行统计分析，结果以（x±s）表示，两组间差异采用t检验，两组以上组间差异采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参对分化不同时期的3T3-L1细胞增殖活力的影响

第4天丹参终浓度为0.6 g/L和0.3 g/L的实验组，与对照组的差异显著（P＜0.05）；其他浓度的实验组与对照组之间无统计学差异（P＞0.05）。

第6天和第8天，实验组与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）（图1-A）。

第4天丹参终浓度为0.02 g/L的实验组与对照组无明显差异（P＞0.05），其余各浓度实验组与对照组的差异均有统计学意义（P＜0.05）。

第6天丹参终浓度为0.04 g/L、0.02 g/L的实验组与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05），其余各浓度实验组与对照组的差异明显（P＜0.05）。

第8天丹参终浓度为0.6 g/L、0.3 g/L的实验组与对照组的差异显著（P＜0.05），其余各浓度实验组与对照组的差异无显著性（P＞0.05）（图1-B）。

第10天测量吸光度值发现，第4天、第6天、第8天加入丹参的实验组和对照组的吸光度值均达到高峰。第4天加入丹参的实验组相比第6天、第8天加入丹参的实验组，以及与对照组之间的差异显著（P＜0.05）；第6天加入丹参的实验组与第8天加入丹参的实验组，以及与对照组之间均存在显著性差异（P＜0.05）（图1-D、图1-E、图1-F）。

第11天测量吸光度值发现，第4天、第6天加入丹参的实验组与对照组存在显著差异（P＜0.05）。第8天加入丹参终浓度为0.02 g/L的实验组与对照组的差异无统计学意义（P＞0.05）（图1-C），其余各浓度均与对照组存在显著性差异（P＜0.05）。

实验结果表明，丹参浓度越大，对3T3-L1细胞增殖的促进作用越大；丹参作用时间越长，其对3T3-L1细胞增殖的促进作用越大。

2.2 丹参对3T3-L1细胞脂质聚积的影响

油红O染色显示，终浓度0.6 g/L的实验组与其他浓度实验组相比，脂滴聚积更多、脂滴更大；对照组与实验组相比差异明显（图2）。

油红O染色阳性面积结果显示，丹参终浓度为0.02 g/L的实验组与对照组的差异无统计学意义；其他个浓度实验组与对照组均存在明显差异，且呈剂量依赖关系（图3）。

2.3 丹参对3T3-L1细胞甘油三酯含量的影响

甘油三酯含量测定显示，实验组与对照组存在显著性差异，并呈剂量依赖关系（图4）。

图1 不同分化时间各组的细胞增殖活力Fig.1Cell viability in each group at different incubation time

图2 油红O染色观察丹参对脂质聚积的影响（100×）Fig.2Photographs of S.miltiorrhiza-treated differentiated adipocytes stained by Oil Red O(100×)

图3 油红O染色阳性面积比较Fig.3The comparison of the positive area by Oil Red O staining

3 讨论

自体脂肪组织作为软组织填充物，具有取材简便、来源丰富、供区损伤小、填充外观好、组织相容性好等优势。但是，较高的吸收率导致了治疗效果存在不确定性。近年来，众多研究都聚焦于提高自体脂肪组织移植的存活率，特别是自体移植脂肪的成活机制等方面。

近年来，有研究探索了中药促进自体脂肪移植存活率的研究，如川穹嗪、黄芪等，获得了能够提高自体脂肪存活率的肯定结果[7]。现代药理研究发现，丹参具有扩张血管、改善微循环、防止心肌缺血和心肌梗死等作用，被广泛用于心血管疾病的治疗。经研究证实，其活性成分不但可以直接保护内皮细胞，还可以通过增加内皮祖细胞的数量，以促进内皮的修复[4]。大量研究表明，丹参可促进多种细胞的分化增殖[5]。我们探讨丹参对前脂肪细胞的分化和增殖的影响，探寻能促进ADSC分化增殖的方法，提高移植脂肪细胞的存活率。

常规的成脂诱导中，在加入诱导液后的第8～12天即可分化为成熟的脂肪细胞，即进入终末分化期，成熟脂肪细胞基本没有增殖的能力。3T3-L1前脂肪细胞的分化，首先让前脂肪细胞增殖，当细胞汇合后进入接触抑制阶段，此时细胞停止分裂增殖；然后在诱导液的刺激下，前脂肪细胞进入特定的细胞分裂期开始克隆扩增；最后进入终末分化期，分化为成熟的脂肪细胞，克隆增殖终止[8]。本研究中，我们利用CCK-8法检测3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞时的增殖活力，即检测终末分化期的细胞增殖活力。结果显示，在终末分化期，实验组细胞仍存在增殖活力，丹参对3T3-L1细胞增殖活力的具有明显的促进作用。卢慧玲等[9]证实，3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞时，部分含有大量脂滴的成熟脂肪细胞仍具有双核，处于细胞分裂期，尚存在分裂增殖的能力。

图4 各组甘油三酯含量Fig.4TG content in each group

我们在诱导后的不同时间点（第4天、第6天、第8天）加入丹参。结果表明，丹参作用时间越长，其对3T3-L1细胞增殖的促进作用越大。在3T3-L1细胞分化的不同时期中，丹参不仅对前脂肪细胞的增殖具有促进作用，即使在第8天，即终末分化期，仍然能促进成熟脂肪细胞的增殖。甘油三酯含量测定和油红O染色也证实了这一点。同时，丹参在促进细胞分化增殖方面具有剂量依赖性，丹参浓度越大，对3T3-L1细胞增殖的促进作用越大。

[1]Tuin AJ,Domerchie PN,Schepers RH,et al.What is the current optimal fat grafting processing technique?A systematic review [J].J Craniomaxillofac Surg,2016,44(1):45-55.

[2]曾昭卫,廖云君,鲁峰,等.游离脂肪移植后脂肪细胞的存活机制[J].中华整形外科杂志,2014,30(3):236-240.

[3]Yoshimura K,Asano Y,Aoi N,et al.Progenitor-enriched adipose tissue transplantation as rescue for breast implant complications [J].Breast J,2010,16(2):169-175.

[4]Lambiase PD,Edwards RJ,Anthopoulos P,et al.Circulating humoral factors and endothelial progenitor cells in patients with differing coronary collateral support[J].Circulation,2004,109(24): 2986-2992.

[5]崔澂,刘秀萍.丹参及其提取物促细胞增殖作用研究进展[J].医学综述,2015,21(24):4528-4531.

[6]Green H,Kehinde O.An established preadipose cell line and its differentiation in culture.II.Factors affecting the adipose conversion [J].Cell,1975,5(1):19-27.

[7]武承兴,王健,张波,等.黄芪对自体脂肪颗粒移植存活率的影响[J].组织工程与重建外科,2013,9(3):141-144.

[8]Gregoire FM,Smas CM,Sul HS.Understanding adipocyte differentiation[J].Physiol Rev,1998,78(3):783-809.

[9]卢慧玲,王宏伟,林汉华.前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞后的再增殖[J].基础医学与临床,2003,23(6):608-611.

Effect of Salvia Miltiorrhiza on Proliferation and Differentiation of 3T3-L1 Cells

ObjectiveTo explore the effect of Salvia miltiorrhiza on proliferation and differentiation of 3T3-L1 cells,so as to provide evidence for further research and clinical application of fat transplantation.MethodsThe differentiating 3T3-L1 cells after adipogenic induction were incubated with different concentration of S.miltiorrhiza(0.6 g/L,0.3 g/L,0.15 g/L,0.075 g/L, 0.04 g/L,0.02 g/L).After the 3T3-L1 cells differentiated into mature adipocyte,the cell proliferation viability was determined by CCK-8 assay kit.The lipid droplets accumulation of adipocyte were observed by Oil Red O staining and Image Pro Plus 6.0.The adipogenesis was quantified by measuring lipid content using triglyceride GPO-POD assay kit.ResultsS. miltiorrhiza promoted a dose-and time-dependent increase in 3T3-L1 cell proliferation viability.The earlier the dosing time was,the better the cell proliferation viability would be;The higher the concentration was,the better the cell proliferation viability would be.Within the six S.miltiorrhiza concentrations confine,S.miltiorrhiza also promoted a dose-dependent increase in 3T3-L1 cell differentiation ability,enhanced the lipid droplets accumulation of 3T3-L1 adipocyte.Conclusion S.miltiorrhiza can promote the increase of adipocyte number via the proliferation and differentiation of 3T3-L1 cells.

Salvia miltiorrhiza;3T3-L1;Cell proliferation;Cell differentiation

R622+.9

A

1673－0364（2017）01－0017－04

LIN Huaian,YU Li,WANG Jian, ZHANG Bo,ZHENG Danning,ZHOU Jia.
Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:YU Li(E-mail: youli@sh163.net)

2016年11月4日；

2016年12月20日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.005

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科。

余力（E-mail：youli@sh163.net）。