王爱丽 徐顺 顾耀辉 黄静 贾卿 陈波

苦参素抑制裸鼠人源增生性瘢痕的初步研究

王爱丽 徐顺 顾耀辉 黄静 贾卿 陈波

目的探讨苦参素对裸鼠人源增生性瘢痕胶原合成和纤维化的抑制作用。方法将人源增生性瘢痕移植到裸鼠背部（n=30），构建增生性瘢痕裸鼠模型。随机分为空白对照组、苦参素涂膜剂组和阳性药组，术后10 d开始分别涂抹空白涂膜剂、苦参素和醋酸曲安奈德涂膜剂，每天2次，连续8周。每周观察并拍照，记录瘢痕生长情况，于术后10 d，以及用药后35 d、49 d和56 d时测量瘢痕面积；HE染色观察组织形态；RT-PCR检测瘢痕中α-SM-Actin和Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达。结果涂抹药物35 d、49 d和56 d，苦参素涂膜剂组瘢痕面积显著缩小，与空白对照组和阳性药组相比差异显著（P＜0.05）；RT-PCR结果显示，与空白对照组相比，苦参素涂膜剂组和阳性药组的α-SM-Actin与Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平显著降低（P＜0.05）。结论苦参素涂膜剂对增生性瘢痕胶原合成有明显抑制作用，并具有抗瘢痕纤维化的作用。【关键词】苦参素涂膜剂增生性瘢痕纤维化

瘢痕增生导致外形异常和功能障碍，给患者带来极大的痛苦[1-2]。增生性瘢痕是真皮损伤后组织异常修复的结果，以成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过度纤维化为特征。其形成机制不明，尚缺乏有效的治疗手段[3]。苦参素具有抗炎、免疫调节和抗肝纤维化作用，用于慢性乙肝的治疗[4-5]。而增生性瘢痕是皮肤创伤愈合过程中的一种过度纤维化病变。研究证实，苦参素在体外能抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖[6]，且使细胞外基质合成下降[7]，细胞凋亡增多[8]。我们的前期研究也证实了这一观点[9]。本实验中，我们将人源增生性瘢痕组织移植到裸鼠背部，使用苦参素涂膜剂涂抹瘢痕，观察苦参对瘢痕的抑制作用和抗纤维化作用，探讨苦参素外用制剂用于增生性瘢痕的临床价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物

苦参素涂膜剂[10]：先分别制取苦参的水煎提取物、乙醇提取物，两者等比例混合，再按提取物30%、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）15%、乙醇30%、甘油20%、氮酮0.5%、蒸馏水4.5%制备涂膜剂，消毒后常温封闭储存。

醋酸曲安奈德涂膜剂：取醋酸曲安奈德（1∶100）溶入空白涂膜剂，消毒后常温封闭储存。

空白涂膜剂：PVP45%、乙醇30%、甘油20%、氮酮0.5%、蒸馏水4.5%制备涂膜剂，消毒后常温封闭储存。

1.1.2 实验动物

单纯T淋巴细胞缺陷（BALB/C-nunu品系）裸鼠（上海中医药大学动物中心），雄性，6～7周龄，体质量18～22 g，SPF级层流架饲养。

1.1.3 仪器与试剂

数码相机、光学显微镜（日本Olympus公司），BCA蛋自定量试剂盒（碧云天生物科技有限公司），RNA提取试剂盒、PCR引物、逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司），鼠抗人α-SM-Actin和Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体（美国Santa Cruz公司），RT-PCR、Western blot检测设备（美国Bio-ard公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物模型构建

裸鼠瘢痕模型的制备：取人源增生性瘢痕组织标本，修剪并去除皮下脂肪组织，分成2.0 cm×2.0 cm、厚约0.25 cm的小块，0.9%生理盐水浸润备用。去除裸鼠背部2.0 cm×2.0 cm全层皮肤，将上述瘢痕标本移植于皮肤缺损处，对称均匀吻合，间断缝合4～6针，打包加压包扎。术后放回无菌层流架继续饲养，饲养条件同术前。每天在移植皮肤处滴加生理盐水以保持创面和移植皮片的湿润，10 d后拆线。

1.2.2 动物分组与用药

将30只裸鼠瘢痕模型随机分为苦参素涂膜剂组10只、阳性药组（醋酸曲安奈德涂膜剂）10只和空白对照组10只，分笼饲养于无菌层流架。于手术后10 d瘢痕生长稳定时（即拆线后）开始用药。分别将制成的涂膜剂涂抹在裸鼠模型背部增生性瘢痕区域，涂抹时按照无菌操作规范进行，药物用量适中，即能在瘢痕表面形成一层薄膜即可；涂抹范围较瘢痕范围略宽。每天2次，持续用药8周。

1.2.3 瘢痕面积的测量

首先用剪耳的方法标记裸鼠，然后使裸鼠背部皮肤处于自然状态且充分暴露下，用精确到0.2 mm的游标卡尺测量瘢痕组织的长、宽，测量时间为术后10 d，以及用药后35 d、49 d和56 d。

1.2.4 组织学观察

于上述时间点对裸鼠瘢痕组织行组织学观察。取裸鼠部分背部瘢痕组织置于10%中性福尔马林中固定24 h；流水冲洗至少5 h；按75%、85%、95%、100%、100%乙醇梯度脱水1 h、50 min、30 min、30 min、30 min；先放入无水乙醇和二甲苯各半的混合液浸泡15～30 min，纯二甲苯中透明；石蜡包埋，切片（40 μm厚）；HE染色，镜下观察。

1.2.5 PCR检测瘢痕组织中细胞因子的含量变化

将瘢痕组织剪碎，裂解，抽提总RNA，合成cDNA（2 μg RNA/20 μL体系，TaKaRa AMV Reverse Transcriptase XL），进行PCR反应。引物序列：①collagenⅠ，正义链5’-GGCGGCCAGGGCTCCGACCC-3’，反义链5’-AATTCCTGGTCTGGGGCACC-3’，产物片段319 bp；②collagenⅢ，正义链5’-TGGTGTTGGAGCCGCTGCCA-3’，反义链5’-CTCAGCACTAGAACTTGTCC-3’，产物片段346 bp；③α-SMActin，正义链5’-GGTGATGGTGGGAATGGG-3'，反义链5'-GCAGGGTGGGATGCTCTT-3'，产物片段188 bp；④β-actin，正义链5’-CGATATGGAGAAGATTTGGCACC-3’，反义链5’-TACGACCAGAGGCATACAGGGAC-3’，产物片段203 bp。反应条件：热变性95℃5 min；35个循环，94℃45 sec、55℃45 sec、72℃1 min；延伸72℃10 min。反应产物于1%Agarose（含0.5 mg/L Ethidium Bromide，EB）进行电泳[11]，Gel-Pro Imager Kit（Media Cybernetics）对各电泳条带的光密度进行定量分析。

1.3 统计学分析

SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，计量数据以（x±s）表示，采用单侧t检验，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 裸鼠瘢痕模型的建立

将人源增生性瘢痕标本移植到裸鼠背部，术后10 d见瘢痕组织存活，瘢痕呈暗红色，质韧，血运良好（图1）。

2.2 苦参素涂膜剂作用后组织形态学变化

将增生性瘢痕标本移植到裸鼠背部10 d后拆线，瘢痕组织存活。HE染色见组织致密，胶原排列紊乱；涂抹苦参素56 d后组织学观察显示，真皮层厚度明显变薄，胶原纤维减少，较疏松，排列相对整齐（图2）。

2.3 苦参素涂膜剂作用后增生性瘢痕面积的变化

术后l0 d瘢痕创面突出皮肤表面，呈暗红色，较硬。用药后35 d、49 d和56 d时，苦参素涂膜剂治疗组瘢痕面积显著缩小，表面趋于平坦，质地变软，颜色变淡，接近于正常肤色，与空白对照组和阳性药组有显著差异（P＜0.05）（图3）。

图1 裸鼠瘢痕模型的建立Fig.1The establishment of animal models of hypertrophic scar

2.4 苦参素涂膜剂对增生性瘢痕组织的Ⅰ、Ⅲ型胶原及α-SM-Actin mRNA表达的影响

RT-PCR结果显示，与空白对照组相比，苦参素涂膜剂组和阳性药组作用于瘢痕组织56 d后，瘢痕组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原、α-SM-Actin mRNA的表达水平明显降低（P＜0.05）（图4、5）。

图2 增生性瘢痕组织学观察Fig.2Histological observation of hypertrophic scar

图3 不同药物组各时间点瘢痕大体观察Fig.3Gross observation of hypertrophic scar in each group

图4 苦参素对增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响Fig.4The effect of Oxymatrine on the expression of CollagenⅠ,Ⅲin hypertrophic scar

图5 苦参素对增生性瘢痕α-SM-Actin mRNA表达的影响Fig.5The effect of Oxymatrine on the expression of α-SM-Actin in hypertrophic scar

3 讨论

增生性瘢痕是创伤后组织过度修复的结果，在伤口愈合过程中，由于炎症反应、过敏、缺氧、内分泌紊乱，以及某些生物化学因素持续作用于损伤部位，导致成纤维细胞活化、增殖、合成胶原并分化异常，直接导致胶原合成与降解的平衡被破坏，胶原的合成明显超过降解，致其大量地不规则堆积，形成增生性瘢痕，其组织学表现为成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过度聚集[12]。另外，皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，也是导致瘢痕不规则增生、挛缩的重要因素。因此，增生性瘢痕抗纤维化的中心策略是抑制成纤维细胞的增殖和分化[13]。研究表明，任何非手术治疗瘢痕的有效方法，均应直接或间接针对抑制成纤维细胞增殖和调整胶原代谢异常这一重要环节[14]。目前，治疗瘢痕的药物存在许多不足，激素类药物产生局部、全身的激素样副作用，钙离子拮抗剂对正常皮肤和心血管有影响，硅制剂透气性能差，易使皮肤产生湿疹甚至溃烂，抗肿瘤药物细胞毒作用大，免疫抑制剂及细胞因子副作用多、价格贵。

因此，将相对低毒的中药应用于瘢痕防治，是一种可能的选择[15]。近年来，中医药在防治增生性瘢痕方而的研究较多[15-16]。中医认为，增生性瘢痕主要有气血瘀滞、经络痹阻、痰湿搏结或三者相辅而成所致，治疗以活而化瘀、软坚散结为主[17]。丹参、川芍、桃仁、当归、雷公藤、青蒿素等药物，均被尝试用于增生性瘢痕的治疗，但用药途径单一，剂型有限，多集中在单味药物或是中药提取物的研究，且以体外研究为主。因此，中医药在防治增生性瘢痕方面的研究还有待突破。

本研究将人源增生性搬痕组织移植到裸鼠背部，使用苦参素涂膜剂涂抹搬痕。结果表明，苦参素涂膜剂对增生性胶原合成有明显抑制作用，并下调B-平滑肌肌动蛋白的表达，促进肌成纤维细胞的凋亡，具有抗纤维化的作用，为进一步临床应用提供了理论依据。

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The Inhibitory Effects of Oxymatrine Coating Agent on Human Hypertrophic Scar

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of Oxymatrine coating agent on hypertrophic scar.Methods Human hypertrophic scar tissues were subcutaneously transplanted into the back of 30 nude mice to create the animal model of hypertrophic scar.Ten days after the operation,the mice were distributed into the control group,Oxymatrine coating agent group and positive medicine group,and were treated with blank coating agent,Oxymatrine coating agent and triamcinolone acetonide acetate coating agent respectively.Drugs were applied 2 times a day for 8 weeks.The growth of the scar was observed and photographed every week,and the size was measured 10 days after operation,and 35,49,56 days after drug treatment.HE staining was used for histological observation.RT-PCR and western blot assessment were used to detect the expression of CollagenⅠ,Ⅲand α-SM-Actin.ResultsAfter drug treatment for 35,49 and 56 days,the scar sizes in Oxymatrine coating agent group shrunk obviously and were much smaller compared with control group and positive medicine group(P＜0.05).According to RT-PCR assessment,the expression of CollagenⅠ,Ⅲand α-SM-Actin were declined sharply in Oxymatrine coating agent group and positive medicine group,compared with the control group.ConclusionOxymatrine coating agent has obvious inhibitory effects on hypertrophic scar,and also has anti-fibrosis effect.

Oxymatrine;Coating agent;Hypertrophic scar;Fibrosis

R619+.6

A

1673－0364（2017）01－0009－04

WANG Aili,XU Shun,GU Yaohui,HUANG Jing,JIA Qing,CHEN Bo．
Burn Unit of Shanghai Seventh People's Hospital,Shanghai 200137,China. Corresponding author:XU Shun(E-mail:xushun197901@163.com).

2016年11月20日；

2017年1月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.01.003

上海市浦东新区卫计委科技发展专项基金面上项目（PW2013A-25）；上海市中医、中西医结合临床重点扶持项目（ZY3-JSFC-1-1014）。

200137上海市上海中医药大学附属第七人民医院烧伤整形科。

徐顺（E-mail：xushun197901@163.com）。