邱新民 徐毅 叶水凤 孟立娜

温郁金正丁醇提取物对胰腺星状细胞活化的影响

邱新民 徐毅 叶水凤 孟立娜⋆

目的 观察温郁金正丁醇提取物对体外人胰腺星状细胞活化的干预作用。方法 采用MTT法选取温郁金正丁醇提取物对于胰腺星状细胞（PSCs）安全且有效的浓度；取胰腺星状细胞分空白对照组、模型组、温郁金组、温郁金干预组，空白对照组未添加温郁金及乙醛等，模型组添加乙醛，温郁金组分低、高浓度温郁金组，温郁金干预组包括低、高浓度温郁金干预组，培养后测定PSCs的α-SMA表达及TGF-β1表达，记录结果，并进行相关性分析。结果 （1）一般情况及胰腺星状细胞大体状态：静止型胰腺星状细胞初代时形态偏球形，四代后活化型胰腺星状细胞偏梭形，拉丝现象常见。（2）MTT：抑制率＜5%的温郁金正丁醇提取物终浓度为0.5mg/L、1mg/L。（3）免疫组化法测定α-SMA表达：温郁金组细胞α-SMA阳性表达率明显较模型组低（P＜0.05）。（4）ELISA检测后的TGF-β1的表达：温郁金组较模型组的细胞TGF-β1表达明显降低（P＜0.05）。（5）相关性分析示：PSCs的TGF-β1与α-SMA表达间呈正相关，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 温郁金正丁醇提取物能有效缓解人类胰腺星状细胞的活化。温郁金正丁醇提取物抑制胰腺星状细胞活化的途径可能与其抑制胰腺组织TGF-β1等表达水平有关。

温郁金 正丁醇 提取物 乙醛 胰腺星状细胞

慢性胰腺炎是以胰腺纤维化为特征的胰腺慢性炎性疾病，胰腺星状细胞（PSCs）在纤维化进程中起重要作用，在各种理化因素作用下，PSCs发生活化，表达α-SMA，胶原蛋白增加，最终导致胰腺纤维化。目前在慢性胰腺炎研究过程中发现，温郁金有减轻胰腺纤维化的作用，现代药理及临床研究均表明温郁金具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理活性［1-2］。作者前期研究［3］发现，温郁金正丁醇提取物可干预大鼠CP胰腺纤维化，其机制可能与温郁金中的姜黄素通过抑制PSCs激活有关。本文探讨温郁金提取物对体外人PSCs活化的干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验仪器及药材、试剂 胰腺星状细胞购于武汉原生原代生物医药科技有限公司（PriCells），置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养，温郁金药材购自浙江省中医院中药房，DMSO购自德州卓越化工有限公司，正丁醇购自杭州大方化学试剂厂，TGF-β1ELISA试剂盒购自武汉博士德公司，大鼠抗人α-SMA单克隆抗体购自武汉博士德公司。

1.2 实验方法 取PSCs分以下各组：空白对照组、温郁金组、温郁金溶剂对照组、模型组、温郁金干预组，空白对照组未添加温郁金及乙醛、DMSO的正常PSCs组；温郁金组为添加温郁金正丁醇提取物的PSCs组；温郁金组分为低浓度温郁金组及高浓度温郁金组：低浓度温郁金组为0.5mg/L，高浓度温郁金组为1mg/L，因温郁金正丁醇提取物难溶于水，故选DMSO在本实验中为PSCs的溶剂，温郁金溶剂对照组为添加DMSO的PSCs组，DMSO含量为0.8%，模型组为添加100mmol/L乙醛的PSCs组，温郁金干预组分低、高浓度温郁金干预组，低浓度温郁金干预组为100mmol/L乙醛+0.5mg/L温郁金正丁醇提取物的PSCs组，高浓度温郁金干预组为100mmol/L乙醛+1mg/L温郁金正丁醇提取物的PSCs组。MTT法时药物浓度分别为：0.5mg/ L、1mg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L，以MTT法测定温郁金正丁醇提取物对于PSCs的安全有效浓度，本实验以此法来选定温郁金药物对PSCs抑制率＜5%的浓度，并以免疫组化法检测PSCs的α-SMA水平，取PSCs上清液检测TGF-β1时采用ELISA法。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料用（x±s）表示，如方差齐性，多组间比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较用最小极差法（LSD-t法）；如方差不齐，组间比较采用非参数秩和检验。两变量间相关性检验采用直线相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT实验结果 对于PSCs抑制率＜5%的温郁金正丁醇提取物浓度是0.5mg/L、1mg/L，两种剂量差异无统计学意义（P＞0.05），之后的温郁金组温郁金正丁醇提取物浓度皆取用0.5mg/L及1mg/L。

2.2 PSCs的α-SMA表达 细胞置于十二孔板24h后，均已贴壁，此时添加各种剂量试剂，24h后各种试剂充分作用于细胞后，行免疫组化检查，以二级计分法统计各组细胞阳性率，结果显示：模型组6例阳性，干预组4例阳性，温郁金组1例阳性，见表1。

表1 模型组、干预组、温郁金组α-SMA灰度值［n=6，（x±s）］

2.3 PSCs上清液TGF-β1表达 见表2。

表2 各组PSCs24h后的TGF-β1检验结果［n=6，（x±s）］

3 讨论

PSCs在胰腺纤维化的发生发展中起关键作用，在各种刺激作用，如细胞因子TGF-β1等作用下，PSCs发生活化、表达α-SMA等蛋白，其本质是以胶原为主的ECM合成增加，降解相对减少，即两者失去动态平衡，致使过多ECM 沉积，从而使胶原纤维增多，最终导致胰腺纤维化发生［4］。

Masamune等［5］发现姜黄素能够抑制PSCs的激活，温郁金正丁醇提取物主要成分是姜黄素。马晓华等［6］研究证实，姜黄素具有抗诱变、抗肿瘤等作用。本资料显示，浓度在0.5mg/L、1mg/L的温郁金正丁醇提取物对于PSCs的抑制率最低，抑制率＜5%。温郁金正丁醇提取物浓度取抑制率＜5%的区间，与乙醛比较观察药物对细胞的活化的影响，经细胞镜下观察，发现温郁金正丁醇提取物对于细胞的活化有抑制作用，对经乙醛诱发的PSCs活化也有抑制作用。α-SMA的表达是PSCs活化的标志之一，静止型PSCs不表达α-SMA，在胰腺发生病变或损伤时，PSCs在各种活化因子作用下失去维生素A脂滴，活化并大量表达α-SMA，本实验经免疫组化证明，乙醛组α-SMA表达呈100%阳性，温郁金+乙醛组有66.7%阳性，温郁金组16.7%阳性，提示加入温郁金正丁醇提取物后，细胞表达α-SMA减少。

PSCs的活化与多种细胞因子相关，如TGF-β1，TGF-β1被认为是较为明确的促胰腺纤维化生长因子，可激活PSCs，刺激其合成包括I型胶原在内的多种ECM，促进胰腺纤维化发生［7］，PSCs活化后可自行分泌TGF-β1。本实验经ELISA检测，温郁金组细胞TGF-β1含量较乙醛组少，差异有统计学意义，温郁金+乙醛组细胞TGF-β1含量与温郁金组、乙醛组差异均有统计学意义。

相关性分析显示PSCs的TGF-β1与α-SMA表达呈正相关（r值分别为0.854，P均＜0.01），提示随着PSCs的TGF-β1表达减少，其α-SMA的表达也随之减少。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部).北京：化学工业出版社, 2005, 194-194.

［2］ 肖培根.新编中药杂志.北京：化学工业出版社, 2002.

［3］ 邱新民, 章复龙, 徐毅.温郁金提取物对胰腺纤维化模型大鼠血清羟脯氨酸的影响.浙江临床医学杂志, 2012, 14(2)：132-134.

［4］ 孙轸,郝建宇,庞宝珍等.吸烟与饮酒致胰腺损伤的实验研究.中华消化杂志, 2010, 30(8)：539-543.

［5］ Masamune A, Satoh M, Kikuta K, et al. Inhibition of p38 mitogenactivated protein kinase blocks activation of rat pancreatic stellate cells. Pharmacol Exp Ther, 2003, 304：8-14.

［6］ 马晓华, 梁海曼, 沃兴德.姜黄素抗肿瘤作用与诱导肿瘤细胞凋亡的研究概况.国外医学肿瘤分册, 1999, 26(1)：21-23.

［7］ Yoo BM, Yeo M, Oh TY, et al.Amelioration of pancreatic fibrosis in mice with defective TGF-beta signaling. Pancreas, 2005, 30：e71-79.

Objective To observe the intervention effect of the Curcuma wenyujin N-butanol Extract to human pancreatic stellate cells activation in vitro，and to explore its possible mechanism. Methods MTT method was used to select for pancreatic stellate cells（PSCs）safe and effective concentration，Divided pancreatic stellate cells into blank control group，model group，curcuma wenyujin group，the intervention group，blank control group without addition of Curcuma and acetaldehyde in the PSCs group，model group to add100mmol/L B PSCs of aldehyde group of Curcuma components，low，high concentrations of Curcuma wenyujin group，respectively，add 0.5mg/L 1mg/L wenyujin Nintaus butanol extract of Curcuma wenyujin PSCs group，intervention group consists of low，high concentrations of Curcuma wenyujin intervention group，low concentrations of the intervention group to add100mmol/L acetaldehyde +0.5mg/L Wen Yu Nintaus butanol extract of PSCs group，high concentration of Curcuma wenyujin intervention group to add100mmol/L acetaldehyde +1mg/L Wen Yu Nintaus butanol extract of group PSCs. Continue to develop after 24h immunohistochemical determination of PSCs α -SMA expression and ELISA method for the determination of PSCs supernatants of TGF-β1 expression，recording of results，and the correlation analysis. Results （1）The general situation and the general state of PSC：the morphology of first generation PSC was similar to the spherical，but the morphology after four generations was similar to the spindle，and drawing phenomenon was common；（2）MTT：The inhibition rate of＜5% were the concentration of 5 mg/L，10mg/L，and 20mg/L of Curcuma wenyujin N-butanol Extract；（3）α-SMA expression： the α-SMA expression of cells added with ethanol，acetaldehyde were positive，cells added with Curcuma wenyujin N-butanol Extract were negative；（4）Content of TGF-β1：TGF-β1 content of the cells added ethanol、acetaldehyde were significantly higher than the cells added t Curcuma wenyujin N-butanol Extract；（5）The correlation analysis indicated： PSCs TGF-β 1 andα -SMA expression positively correlated between（R values were respectively 0.854，P＜0.01），there were significant differences in statistical analysis. Conclusion Curcuma wenyujin N-butanol extract can effectively reduce the activation of human pancreatic stellate cell（PSC），its mechanism may be related to the inhibition of the expression of the TGF-β1 of pancreatic tissue.

Curcuma wenyujin N-butanol Extract Pancreatic Stellate Cells（PSCs）

310000 杭州市余杭区第一人民医院（邱新民 叶水凤）

310006 浙江中医药大学第一附属医院（孟立娜 徐毅）

*通信作者