孔小勇，曹永楠

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁 223800）

正丁醇是浓香型白酒重要的芳香组分和呈味物质，对窖香浓郁、绵厚味长的风格形成和舒适的饮用体验起到重要作用。浓香型白酒中正丁醇含量在5～50 mg/100 mL，高于其他香型白酒，适量的正丁醇可提高白酒的浓厚感并增加协调性，但含量过高会带来味苦微涩、醉酒上头等不良饮用体验。

当前研究表明，正丁醇的生成与梭菌的物质代谢有关。窖池作为浓香型白酒的发酵容器，栖息着种类丰富、数量众多的梭菌，是各类微生物进行一系列生化反应的重要场所。窖泥中某些梭菌属微生物利用含淀粉、纤维素或糖类物质的谷物原料作为主要碳源和能量来源，代谢生成正丁醇。本研究通过采集窖内不同位置、发酵时间节点的酒醅，分析浓香型白酒发酵过程正丁醇的生成规律；筛选产正丁醇含量差异显著的窖泥进行微生物分离，分析产正丁醇的主要微生物的种类及能力；跟踪比较不同生产排次、酿酒车间的生产情况，梳理出影响正丁醇生成的主要工艺因素，为调控酒中正丁醇含量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

窖泥和酒醅：取自洋河酒厂各酿酒车间，窖泥和出入窖酒醅置于-80 ℃冻存，大曲室温保存。

1.1.2 培养基

胰蛋白胨生理盐水溶液：胰蛋白胨1 %，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，121 ℃灭菌15 min。

RCM 培养基：蛋白胨1%，牛肉浸粉1%，氯化钠0.5 %，葡萄糖0.5 %，酵母浸粉0.3 %，可溶性淀粉0.1 %，L-半胱氨酸盐酸盐0.05 %，121 ℃灭菌15 min。

P2发酵培养基：葡萄糖6%，酵母粉0.3%，碳酸钙0.3%，磷酸二氢钾0.1%，七水硫酸镁0.002%，七水硫酸亚铁0.001 %，氯化钠0.001 %，对氨基甲苯0.0001 %，维生素B1 0.0001 %，生物素0.0001 %，121 ℃灭菌15 min。

1.1.3 试剂

正丁醇标准品，美国Sigma-Aldrich 公司；基因组DNA 提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。

1.1.4 仪器设备

酒醅取样器，自制；气相色谱仪，日本岛津公司；高效液相色谱(1200)，美国Agilent 公司；立式压力蒸汽灭菌锅，上海书俊仪器设备有限公司；恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；超低温冰箱，上海跃进医疗器械厂；低温冷冻离心机，盐城市安信实验仪器有限公司；超纯水制备仪，美国赛默Thermo 公司；漩涡混合器，上海琪特分析仪器有限公司；pH计，上海仪迈仪器科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酒醅中正丁醇的测定

（1）提取条件：50 g 酒醅，17 %vol 乙醇溶剂体积150 mL，馏分体积15 mL。

（2）检测条件：载气N，流速1 mL/min，进样口温度270 ℃，进样量1 μL，分流比50∶1，cpwax57CB 型（cp-97723A）毛细管色谱柱，50 m*0.25 mm*0.25 μm；程序升温，35 ℃保持6 min，6 ℃/min 升温至60 ℃，保留3 min，再以4.5 ℃/min升温至80 ℃，保留2 min，9.5 ℃/min升温至180 ℃，保留2 min，9.5 ℃/min 升温至210 ℃，保留10 min；FID检测器，300 ℃，H30 mL/min，空气300 mL/min。

1.2.2 产正丁醇微生物的分离纯化与鉴定

（1）分离：称取10 g 窖泥与100 mL TPS 缓冲液混合，80 ℃处理10 min 以杀死非芽孢状态的菌体及其他营养细胞，室温放置20 min 富集菌体，再置于80 ℃处理10 min，待冷却至30～40 ℃时，以10 %的接种量转移至乙酸钠液体培养基，37 ℃厌氧富集培养7 d。取1 mL 菌液稀释涂布于RCM 固体培养基，37 ℃厌氧培养2～5 d。观察培养皿中微生物生长情况，挑取不同形态的菌落划线分离3次及以上，得到菌株的纯培养物。

（2）鉴定：使用DNA 提取试剂盒提取分离到的细菌基因组DNA，对获得的总基因组DNA 进行16S rDNA 的PCR 扩增，将测序结果提交至Gen-Bank数据库进行BLAST比对，鉴定种属。

（3）产正丁醇能力评价：挑取单菌落接入RCM液体培养基，37 ℃静置厌氧培养24 h，以10%接种量接种至P2 培养基，37 ℃厌氧发酵3 d，测定正丁醇含量。

2 结果与分析

2.1 浓香型白酒酿造过程正丁醇的变化规律

2.1.1 不同生产排次正丁醇变化规律

通过对比浓香生产全周期中4 个排次原酒正丁醇的变化（图1），可知头排酒发酵周期最长，达到150 d，原酒正丁醇含量相对最高，在超长期压窖时期里，窖内进入以厌氧细菌生长代谢为主导的半固液态发酵阶段，正丁醇含量不断累积，为正丁醇的生成提供时间上的优势。随着排次流转，原酒正丁醇逐渐降低，四排酒生产结束后再进入超长期压窖，正丁醇升高，循环往复，规律明显。

图1 浓香工艺中不同排次原酒中正丁醇含量比较

2.1.2 窖内不同醅层正丁醇的分布

在酒醅发酵结束、出池环节采集窖内不同位置酒醅和黄水样品，窖内自上而下依次是回缸醅、小米查醅、大米查醅、双轮底。正丁醇含量检测结果见图2，不同位置的酒醅和黄水中正丁醇含量分布差异明显，黄水中正丁醇含量最高，双轮底长期与窖底泥接触，浸没在黄水之中，正丁醇含量仅次于黄水，大米查醅位于窖池中下层，正丁醇含量低于双轮底，小米查醅位于窖池中上层，正丁醇含量最低，回缸醅位于窖内最上层，与封泥直接接触，回缸醅中正丁醇含量高于大米查、低于双轮底，介于两者之间，窖内整体呈现“上下高、中间低”的规律，说明与窖泥充分接触可促进正丁醇的生成。

图2 窖内不同位置醅层正丁醇含量差异比较

以入池酒醅作为培养基，在培养箱内模拟发酵，对比有无窖泥参与发酵的情况下酒醅中正丁醇的含量，结果见图3，在相同的培养条件下，有窖泥参与的模拟发酵酒醅中正丁醇含量均高于无窖泥参与的酒醅样品，且随着窖泥接种量的增加，酒醅中正丁醇含量也呈逐渐升高趋势。综上可知，窖泥是浓香型白酒中产正丁醇微生物的重要载体，这为后续筛选分离产正丁醇微生物的研究指明方向。

图3 不同窖泥接种量下酒醅中正丁醇含量差异

2.1.3 窖内不同发酵时期正丁醇的生成规律

采集窖内不同位置、不同发酵时间节点酒醅进行正丁醇检测，结果见图4，大米查、小米查和回缸在入池环节正丁醇基本检测不到；在入池14～21 d 之后，正丁醇呈快速增长趋势。双轮底因上一轮未蒸烧而直接入池，故正丁醇在初始阶段含量高于其他醅层，随着发酵的进行，正丁醇含量逐渐升高。可以得知各醅层中正丁醇含量变化趋势基本一致，均是随着发酵周期的延长而逐渐升高，这是因为在发酵的前14 d中，主要是大曲微生物（如芽孢杆菌、酵母、霉菌等好氧或兼性厌氧细菌）在有氧条件下进行淀粉质原料的糖化和蛋白质的水解，同时伴随着氧气的消耗；发酵14 d 后窖内氧气基本消耗完毕，窖泥中的厌氧功能微生物逐渐活跃，正丁醇开始形成。随着浓香抽黄水作业的进行，出池醅中正丁醇含量有所下降，黄水对酒醅中正丁醇有较好的洗脱效果。

图4 窖内酒醅中正丁醇含量随发酵周期的变化趋势

2.2 正丁醇生成途径的解析

2.2.1 窖泥中产正丁醇微生物的筛选分离

采用RCM 培养基从窖泥中共分离得到8 株梭菌，通过16S rRNA 序列比对鉴定分别为拜氏梭菌（）、楔形梭菌（）、巴布利丁酸梭菌）、肠梭菌（）、丁酸梭菌（）、预耳蜗梭菌（）、酪丁酸梭菌（）、第三梭菌（），采用P2 培养基考察上述8 株梭菌产正丁醇能力的差异，如表1 所示，其中产丁醇能力最强（1027.7 mg/100 mL），产丁醇能力最弱（14.2 mg/100 mL）。

表1 浓香型白酒窖泥中梭菌的分离与鉴定

2.2.2 窖泥中拜氏梭菌的定量分析

为了进一步验证拜氏梭菌（）是浓香型白酒发酵过程中正丁醇合成的主要微生物，采用实时荧光定量PCR法对原酒正丁醇含量高中低分类（H、M、L）的3 个窖池窖泥进行的生物量检测。结果显示，3 份窖泥样品中的含量存在显著性差异，不同窖泥中含量与原酒中正丁醇含量规律一致，即原酒正丁醇含量高的窖池窖泥含量也高，这也进一步证实是参与正丁醇合成的主要微生物。

2.2.3 正丁醇生成途径解析

根据高级醇两条经典代谢途径——氨基酸分解代谢途径（Ehrlich 途径）和糖代谢合成途径（Harris 途径），参与正丁醇生成的前体物质有糖、有机酸和氨基酸三大类。设计添加试验比较各类前体物质的贡献程度，分别选择3种糖类葡萄糖、麦芽糖和甘油作为前体碳源，3种有机酸乙酸、乳酸和丁酸作为前体有机酸，3种氨基酸谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸作为前体氨基酸，选择RCM 为基础培养基，添加相同量的9种前体物质，考察各前体物质对正丁醇生成的影响。如图5所示，各类前体物质中对正丁醇生成量影响由高到低分别是丁酸、葡萄糖、乙酸、麦芽糖、谷氨酸、天冬氨酸、甘油、乳酸、苏氨酸，其中添加丁酸和葡萄糖显著高于其他前体，丁酸试验组正丁醇生成量高达1865 mg/100 mL，较对照高出3.4 倍，葡萄糖试验组正丁醇生成量1668 mg/100 mL，较对照高出3 倍。氨基酸的种类对正丁醇的生成量有较大影响，其中谷氨酸和天冬氨酸对正丁醇的生成有明显促进作用，添加苏氨酸生成的丁醇含量与对照相当，可知苏氨酸不是合成正丁醇的主要底物。综上，梭菌主要通过糖代谢合成途径（Harris 途径）合成正丁醇，其中葡萄糖和丁酸是影响正丁醇产量的最重要的前体物质。

图5 添加不同前体物质对正丁醇生成的影响

3 结论与展望

本研究以浓香窖内不同位置、不同发酵时间节点的酒醅中正丁醇含量为研究对象，分析了酒醅中正丁醇的生成和分布规律，明确了浓香型白酒4 个生产排次中正丁醇从头排酒至四排酒逐排下降，循环往复，规律明显；窖内酒醅中正丁醇主要于发酵中后期14～21 d 之后开始快速生成；靠近窖泥的酒醅中正丁醇含量相对较高，具体表现为黄水＞双轮底＞回缸＞大米查＞小米查，整体大致呈现“上下高、中间低”的规律，说明与窖泥充分接触能够促进正丁醇的生成，窖泥是浓香型白酒中产正丁醇微生物的重要载体。

表2 不同窖泥理化指标与C.beijerinckii含量

针对筛自窖泥的拜氏梭菌、巴布利丁酸梭菌和酪丁酸梭菌等8 株梭菌进行产正丁醇能力评价，结果表明，产丁醇能力最强；以荧光定量PCR 法分析不同窖泥中的生物量，进一步证实是浓香型白酒发酵过程中正丁醇合成的主要微生物；通过设计添加糖、有机酸和氨基酸等三类9 种物质，得知丁酸和葡萄糖试验组显著高于其他组，说明了糖代谢合成途径（Harris途径）是合成正丁醇的主要途径。

本研究仅对正丁醇的生成规律和代谢途径做了初步研究与验证，尚未涉及产正丁醇梭菌的生长代谢特性、利用微生物扰动调控正丁醇技术的研究，这也是后续工作的重要研究方向。浓香型白酒生产工序繁多、工艺参数匹配复杂，难以用绝对的、统一的工艺参数去调控正丁醇的生成，例如生产过程中入池水分过大，窖内黄水液位升高，窖内提前进入厌氧环境，为具有运动性的产正丁醇梭菌创造空间和时间上的优势。此外双轮底留取数量过多，相当于在酒醅入池阶段就接种了大量梭菌，进而影响到整个窖内正丁醇的含量，双轮底自身经过多排次发酵，正丁醇含量会继续升高，若使用不合理，会将更多的正丁醇富集到原酒中。这需要我们尊重传统工艺，全面深刻的认识微生物特性及代谢规律，灵活应用到酿酒生产中，科学制定并严格执行工艺参数，促进整个窖内发酵系统的良性循环。