潘治斌 唐春燕 徐仁伵

(九江市第一人民医院神经内二科，江西 九江 332000)

C9orf72在肌萎缩侧索硬化发病机制中的作用

潘治斌 唐春燕1徐仁伵1

(九江市第一人民医院神经内二科，江西 九江 332000)

C9orf72；肌萎缩侧索硬化；致病机制

肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种累及上下运动神经元的慢性进行性神经退行性疾病。患者主要表现为肌肉萎缩、腱反射亢进等上下运动神经元损害的症状、体征。ALS目前尚无有效的治疗方法，患者多于3～5年内死于呼吸机麻痹。目前认为ALS的发病与遗传因素、病毒感染、氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、神经营养因子缺乏等多种因素有关〔1〕。迄今为止已经发现多种ALS突变基因，如：SOD-1、TDP43、FUS、C9orf72、VAPB 、OPTN、UBQLN2、ATXN2等。早在2011年，Dejesus等〔2〕和Renton等〔3〕学者首次分别在ALS和额颞叶痴呆(FTD)患者检测出C9oRF72基因GGGGCC六核苷酸重复扩增现象〔2，3〕，目前已被认为是ALS发病最主要的突变基因。本文对C9orf72基因在ALS发病中的作用做一综述。

1 C9orf72基因及功能简介

C9orf72基因(9号染色体开放阅读框72基因)位于9号染色体短臂(9p21)，编码11个外显子，具有3个转录本，翻译2个蛋白亚型。C9orf72基因的六核苷酸GGGGCC(G4C2)重复序列在非编码区第1内含子内，位于1a和1b外显子间。外显子1a参与编码转录本1和3，外显子1b参与编码转录本2。转录本2和3共同翻译长的蛋白亚型a，转录本1则翻译短的蛋白亚型b。C9orf72基因正转录方向产生GA、GR、 GP聚合物，反转录方向翻译PA、GP、PR聚合物。在ALS患者神经系统，C9orf72主要存在表达于神经元细胞内。C9orf72的功能仍然不明确，有待进一步研究。有研究认为C9orf72功能与膜转运及细胞自噬有关〔4〕。C9orf72被发现与Rab家族的多个Rab存在共定位，如介导细胞内吞作用的Rab5、Rab7，及介导细胞自噬的Rab1、Rab11，这种共定位可在培养的神经元的细胞中发现，但在C9orf72阳性的ALS患者显著增强〔5〕。同时发现C9orf72阳性的神经元细胞存在膜转运减弱及自噬体形成障碍。

2 C9orf72 G4C2致病重复

在健康人群，C9orf72的G4C2重复次数在2～23之间波动，90%的欧洲人G4C2重复次数在2～10之间，正常人>30的重复次数比较罕见。正常范围内重复次数分为短长度重复次数(<7次)和中间长度重复次数(7～23次)，中间长度重复次数可致基因转录活性降低，更倾向于致病，具体机制尚不明确。在FTD和ALS G4C2重复扩增达700～1 600，甚至达几千〔2，3〕。20至数百个重复次数在健康人群及FTD和ALS患者均有报道。目前上百个G4C2重复被认为是致病的，但最小的G4C2致病重复次数仍然是不清楚。

3 C9orf72 G4C2致病重复相关疾病

从流行病学角度，C9orf72 G4C2致病重复在肌萎缩侧索硬化、额颞叶痴呆、帕金森病等多种神经变性病患者基因中被检测到。欧美的大型研究发现，50%～60%的家族性ALS和10%的散发性ALS患者存在C9orf72 G4C2致病重复〔6〕。国内针对中国汉族人群200例ALS的GWAS研究也检测出9例C9orf72突变〔7〕。C9orf72相关的ALS发病时间早，病情进展迅速，常伴有认知障碍和行为异常。

FTD主要表现为行为异常和认知功能减退，神经影像学表现为额叶和颞叶皮质萎缩。40%～50%的FTD患者有明确的家族史，多为常染色体显性遗传。根据数据，18%-24%的家族性FTD及6%-10%的散发性FTD患者发病主要原因是C9orf72 G4C2致病重复扩增〔8〕。C9orf72 G4C2重复相关的ALS常有痴呆等FTD症状，部分FTD的患者也会出现ALS的表现，说明ALS-FTD可能存在共通的致病原因，可能与C9orf72 G4C2致病重复有关。

TDP-43包涵体形成是FTD和ALS共同的病理特征。Hsiung等〔9〕发现C9orf72 G4C2致病重复相关的FTD患者的多个脑区存在广泛的TDP-43包涵体，如额叶运动皮层、海马、下运动神经元，这些患者有的同时有典型的ALS的临床表现。值得一提的是，TDP-43不是C9orf72 G4C2致病重复单一的致病机制。在小脑皮质颗粒细胞检测出了泛素/P62阳性、TDP-43阴性的包涵体，说明泛素/P62也参与C9orf72G4C2重复的神经病理学。

临床诊断的PD患者C9orf72G4C2重复的检出率较低，仅有不到1%的患者存在G4C2重复扩增，其中>60个重复次数的不到0.2%。更大型的全球化的研究检出率更是只有0.055%。有趣的是，G4C2重复阳性的帕金森病患者通常症状不典型，并通常伴有进行性的痴呆。也有报道发现G4C2重复扩增在进行性核上性眼肌麻痹、多系统萎缩、皮质纹状体变性等帕金森综合征患者被检出，但阳性率较低〔10〕，目前主要认为C9orf72G4C2重复扩增不是PD主要的病因。

C9orf72致病性G4C2重复扩增也在阿尔茨海默病、亨廷顿病等神经系统疾病中检测到，但都不是主要的致病原因。C9orf72 G4C2致病重复可能与这一类疾病相关，看似独立的疾病之间可能存在共同的神经病理及分子致病机制。

4 C9orf72致病机制

关于C9orf72六核苷酸重复序列如何致病仍然是不明确的，目前主要存在三种假说：(1)C9orf72基因表达减少及功能丧失；(2)重复系列转录的RNA毒性；(3)C9orf72六核苷酸重复序列诱发异常蛋白聚集。

4.1C9orf72基因蛋白表达减少及功能丧失 有学者提出，C9orf72基因G4C2重复序列是一种“功能失活突变”〔11〕，重复序列引起C9orf72基因原有的功能受损或丧失。G4C2重复序列在转录本1和3位于内含子内，在转录本2位于启动子中。最早有学者在体外培养的C9orf72转基因细胞内发现转录本2的转录水平下降。另外有实验〔12〕在C9orf72相关的ALS/FTD患者神经元内发现C9orf72基因表达水平下降。

关于C9orf72G4C2重复扩增如何影响C9orf72表达水平有多种假说。G4C2重复扩增的DNA、RNA可形成G-四链体和R-循环结构，C9orf72重复扩增相关的DNA可形成维持稳定的G-四链体和抗稳定的G-四链体，而RNA只能形成抗稳定的G-四链体，这种特殊的特征可直接影响RNA转录、剪接及翻译过程，导致C9orf72转录障碍。Haeusler在C9orf72转基因细胞内发现特异性结合C9orf72重复扩增G-四链体结构的核仁素蛋白在细胞核内存在错误定位，这可引起细胞核功能障碍及基因转录水平降低〔13〕。

另外，基因过甲基化也被认为是影响转录的重要原因。已发现G4C2重复可引起C9orf72基因座过甲基化。CpG岛的胞嘧啶过甲基化被认为是包括C9orf72 G4C2重复在内的重复扩增相关疾病引起基因表达减少的原因之一〔14〕。伴随着G4C2重复扩增，CpG碱基大量增加，这为CpG岛过甲基化提供了丰富的材料。实际上，运用亚硫酸氢盐测序检测CpG岛甲基化已经发现C9orf72突变携带者存在C9orf72基因座过甲基化。除了CpG甲基化以外，在表观遗传学角度，赖氨酸残基的组蛋白甲基化也被认为是影响基因表达的重要原因。已经有研究在C9orf72突变者的血液C9orf72基因发现组蛋白H3、H4三甲基化〔15〕。

这些假说只是阐述C9orf72基因表达减少的部分机制，且仍有待进一步验证。

4.2获得性RNA毒性 获得性RNA毒性被认为是C9orf72G4C2重复扩增致病的重要原因。为了验证C9orf72阳性的ALS/FTD患者是否存在RNA灶，Dejesus-Hernandez等〔2〕对C9orf72阳性的ALS/FTD患者额叶皮层及脊髓切片进行RNA荧光原位杂交，发现25%的细胞核内存在多个RNA灶。Mizielinska等〔16〕也发现C9orf72阳性的ALS/FTD患者皮层、小脑、海马及脊髓的运动神经元细胞、形成胶质细胞、小胶质细胞内存在RNA灶，其中运动神经元细胞内明显多于其他细胞，这也进一步说明RNA灶可能特异性损伤运动神经元。另外，这一发现也在体外实验中得到重复。Donnelly等〔17〕诱导C9orf72阳性的多功能干细胞特异性分化成运动神经元细胞，并在细胞核内检测到RNA灶形成。

多项研究证明RNA灶产生细胞毒性。有学者发现C9orf72 G4C2重复扩增的神经元细胞，尤其是运动神经元细胞的自发活动减少〔18〕。同时，多功能干细胞分化的神经元细胞也出现兴奋性谷氨酸毒性增强，这也是ALS发病的重要原因之一。G4C2重复序列转录或反转录的RNA在细胞核内聚集形成RNA灶，RNA灶可分离RNA结合蛋白，使RNA结合蛋白在细胞内的正常功能丧失，如mRNA选择性剪接作用。

然而，受影响的究竟是哪种RNA结合蛋白，这仍在研究中。值得一提的是一种与RNA灶毒性密切相关的疾病，强直性肌营养不良I型(DM1)。DM1发病主要是DMPK基因CTG致病重复扩增。已经发现DM1的特异性RNA结合蛋白MBNL，上调MBNL后的DM1小鼠模型症状可明显改善〔19〕。这为寻找C9orf72 G4C2重复扩增的特异性RNA结合蛋白提供了一个方向，已经提出了多种可能，如SRSF2，hnRNP H1/F，ALYREF，hnRNPA3，hnRNPA1，hnRNP-H，nucleolin，Pur-α，ASF/SF2，ADARB2，RanGAP1等，这些蛋白需要在未来的研究中进一步明确。

4.3异常蛋白聚集 错误折叠的蛋白质在细胞内异常聚集、形成包涵体是许多包括ALS在内的神经退行性疾病的特征。如阿尔茨海默病的β-淀粉样蛋白、帕金森病的α-突触核蛋白等。众所周知，ALS患者神经元细胞内存在TDP-43包涵体，这是ALS特征性病理改变。C9orf72 G4C2重复扩增被认为与蛋白质异常聚集密切相关。G4C2重复转录及反转录的RNA通过异常的RAN翻译模式(重复序列相关非ATG模式)，翻译出二肽重复蛋白(DPRs)GA、GR、GP、PA、GP、PR聚合物，这些蛋白在神经细胞内异常聚集产生神经毒性。DPRs聚合物广泛存在于C9orf72阳性的大脑皮层、小脑及海马神经元细胞内。目前已经有多项实验证明DPRs可引起神经退行性病变。有实验发现，在缺乏RNA灶的初级神经元细胞，GA聚合物的表达可破坏蛋白酶体的活性，诱发内质网氧化应激，产生神经毒性〔20〕。另外，有研究认为，GA聚合物可诱导毒性淀粉样蛋白在细胞内异常聚集，并以类似朊病毒感染的方式在细胞间传播〔21〕。GA聚合物的毒性也在动物实验中得到验证。C9orf72转基因小鼠产生丰富的GA病理改变，表现出神经退行性改变及行为异常，这可能是由于GA影响了参与蛋白酶体降解的HR23的分离。

PR、GR聚集物也参与神经损伤过程。在中枢神经系统胶质细胞，PR、GR聚集物重组可引起大量RNA加工改变，产生神经毒性。DPRs可进入神经元细胞核内，并与核仁定位相同，者意味着DPRs可影响rRNA的加工过程〔22〕。体内及体外实验均已证实，PR聚合物可在运动神经元细胞核内聚集，引起神经元死亡〔23〕。在果蝇体内，GR、PR 50以上的重复可产生神经毒性。

研究认为，C9orf72可引起胞核胞质转运功能障碍〔24〕。RNA及产物蛋白转入转出细胞核是细胞内重要的高度调节的过程。核质转运功能障碍可解释包括TDP-43在内的RNA结合蛋白在细胞质内异常聚集的现象。这些猜想仍有待进一步证实。

综上所述，近年来关于C9orf72G4C2致病重复的研究有了一定的认识，但对于C9orf72基因的确切功能、重复次数与疾病发生的关系、G4C2重复扩增具体的致病机制等问题仍然缺乏确切的解释。鉴于C9orf72 G4C2致病重复是引起ALS的主要的遗传性病因，同时又与FTD等其他一类神经退行性疾病相关，因此在现有研究的基础上进行进一步的探索是十分必要的，这将为ALS的治疗提供新的靶点。

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〔2016-11-17修回〕

(编辑 袁左鸣)

R744.8

A

1005-9202(2017)18-4677-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.115

国家自然科学基金资助项目(30560042，81160161，81360198)

1 南昌大学第一附属医院神经科

徐仁伵(1969-)，男，教授，主任医师，博士生导师，主要从事肌萎缩侧索硬化和帕金森病的发病机制和防治研究。 唐春燕 (1992-)，女，硕士，主要从事肌萎缩侧索硬化的防治研究。

潘治斌(1983-)，男，硕士，主要从事肌萎缩侧索硬化的防治研究。