包建忠 张震宇 叶红波 黄 钰 彭 琪

(深圳市坪山新区妇幼保健院药剂科，广东 深圳 518122)

碘过量不同处理时间对Fischer大鼠甲状腺细胞线粒体过氧化损伤的影响

包建忠 张震宇 叶红波 黄 钰 彭 琪

(深圳市坪山新区妇幼保健院药剂科，广东 深圳 518122)

目的探讨碘过量不同处理时间对Fischer大鼠甲状腺细胞线粒体过氧化损伤的影响。方法采用含0(对照组)、0.1 mmol/L碘化钾的Coons F12培养基培养Fischer大鼠甲状腺细胞2、6 h、1 d，对小鼠抗大鼠细胞色素C蛋白、死亡细胞百分比、线粒体超氧化物生成、乳酸脱氢酶活力进行检测分析研究。结果0.1 mmol/L碘化钾组处理2 h、6 h、1 d时，小鼠抗大鼠细胞色素C强阳性细胞率远高于对照组(P<0.05)；Fischer大鼠甲状腺细胞线粒体超氧化物生成明显高于对照组(P<0.05)，且处理2 h时增长幅度最大；随着0.1 mmol/L碘化钾处理时间的增加，培养液上清中乳酸脱氢酶活力程序持续增加趋势，处理2、6 h、1 d时乳酸脱氢酶活力明显高于对照组(P<0.05)。结论碘过量处理2 h可能会导致Fischer大鼠甲状腺细胞线粒体发生过氧化损伤，而处理1 d则极有可能导致细胞凋亡。

碘过量；Fischer大鼠；甲状腺细胞线粒体；过氧化损伤

碘对甲状腺滤泡上皮细胞的分泌和生长具有重要作用。研究表明〔1〕，对碘具有较高敏感性的人，尤其是患有隐性甲状腺疾病者，摄取过多碘会引发或加重机体免疫性甲状腺疾病。运用5、20 mmol/L碘化钾对不灭的甲状腺细胞系进行48 h处理，可有效延缓甲状腺细胞生长，促使细胞坏死或凋亡〔2〕。此外，产生细胞中活性氧的主要场所为线粒体，同时也是凋亡触发的靶点。本研究探讨碘过量不同处理时间对Fischer大鼠甲状腺细胞线粒体过氧化损伤的影响。

1 材料与方法

1.1仪器及试剂 (1)流式细胞仪；倒置荧光显微镜；(2)DNA ladder检测试剂盒；乳酸脱氢酶活力检测试剂盒；山羊抗小鼠二步法免疫组化试剂盒；小鼠抗大鼠细胞色素C单克隆抗体及线粒体超氧化物指示剂。

1.2细胞培养 将Fischer大鼠甲状腺细胞放置于Coons F12培养基中，将0.25%链霉素、0.25%青霉素、1 U/L促甲状腺激素、0.3 g/L谷氨酰胺、5.0 μg/L氢化可的松、5.0 mg/L转铁蛋白、10.0 mg/L胰岛素及5.0%新生小牛血清加入其中，随后放于37℃的100.0%湿度培养箱中，每间隔4 d更换1次液体。

1.3处理方法 采用含0(对照组，n=6)、0.1 mmol/L碘化钾的Coons F12培养基培养Fischer大鼠甲状腺细胞2 h、6 h、1 d(n=6)。

1.4小鼠抗大鼠细胞色素C蛋白 首先处理细胞爬片，随后通过免疫组化二步法对小鼠抗大鼠细胞色素C蛋白进行检测；评定标准为强阳性：棕黄色粗大颗粒；阳性：黄色中等大小颗粒；弱阳性：淡黄色细小颗粒。每个爬片选择5个400倍视野，每个视野计数100个细胞，统计强阳性细胞总数后计算强阳性细胞率，强阳性细胞率=(强阳性细胞总数/细胞总数)×100.0%。

1.5死亡细胞百分比检测 在6孔板接种Fischer大鼠甲状腺细胞，进行3 d贴壁培养，并通过0.1 mmol/L碘化钾处理2、6 h、1 d，随后收集贴壁细胞，并进行10 min离心；随后通过70%乙醇对其进行固定处理，放置在4℃环境中过夜保存；将200 mg/L RNA酶和50 mg/L 碘化丙啶与其混合；利用流式细胞仪对其亚二倍体峰进行测定，死亡细胞百分比=(亚二倍体细胞总数/细胞总数)×100.0%。

1.6线粒体超氧化物生成检测 将已完成处理的Fischer大鼠甲状腺细胞放入5.0 μmol/L 线粒体超氧化物指示剂中，放置在37℃的环境中避光放置0.5 h；通过流式细胞仪对线粒体超氧化物指示剂平均荧光强度进行测定，并利用线粒体超氧化物指示剂平均荧光强度反应线粒体超氧化物生成量。

1.7乳酸脱氢酶活力检测 通过比色法对乳酸脱氢酶活力进行测定。

1.8统计学方法 应用SPSS19.0软件进行χ2检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1小鼠抗大鼠细胞色素C蛋白检测结果 对照组细胞呈上皮样生长，胞膜较为完整，胞核为椭圆形，体积较大，生长状态较为良好，且以细胞质中有均衡分布的淡黄色小鼠抗大鼠细胞色素C阳性颗粒的细胞为主；0.1 mmol/L碘化钾处理2 h后，细胞质中有棕黄色的粗大小鼠抗大鼠细胞色素C阳性颗粒的细胞数增加，并且部分细胞膜发生缺损；0.1 mmol/L碘化钾处理6 h后，细胞质中有棕黄色的粗大小鼠抗大鼠细胞色素C阳性颗粒的细胞数与处理2 h相比更多，并且颜色更深；0.1 mmol/L碘化钾处理1 d后，棕黄色颗粒完全包围蓝色细胞核，并可发现细胞发生破碎，小鼠抗大鼠细胞色素C颜色变淡。0.1 mmol/L碘化钾组处理2、6 h、1 d时，小鼠抗大鼠细胞色素C强阳性细胞率(34.2%±3.5%，44.7%±5.4%，30.2%±6.0%)远高于对照组(13.7%±1.1%，P<0.05)。

2.2死亡细胞百分比检测结果 0.1 mmol/L碘化钾处理2、6 h、1 d时死亡细胞百分比(7.41%±0.11%，9.18%±0.13%，12.69%±0.15%)均明显高于对照组(4.55%±0.19%)(P<0.05)，且随着处理时间的增长，死亡细胞比例持续升高。

2.3线粒体超氧化物生成检测结果 0.1 mmol/L碘化钾处理Fischer大鼠甲状腺细胞2 h，线粒体超氧化物指示剂平均荧光强度高达对照组的5.19倍，处理6 h高达2.18倍，处理1 d高达2.03倍。经荧光显微镜辅助可知，对照组细胞质中红色的线粒体超氧化物指示剂荧光强度较弱；0.1 mmol/L碘化钾处理2 h后，荧光强度显著增强，表明线粒体超氧化物生成显著提升；而处理6 h及1 d时荧光强度开始下降，表明与处理2 h相比，线粒体超氧化物生成降低，但依旧高于对照组。

2.4乳酸脱氢酶活力检测结果 随着0.1 mmol/L碘化钾处理时间的增加，培养液上清中乳酸脱氢酶活力程序持续增加趋势，处理2、6 h、1 d时乳酸脱氢酶活力〔(1.74±0.21)U/mg、(6.52±0.13)U/mg，(8.24±0.23)U/mg〕明显高于对照组〔(0.78±0.03)U/mg，P<0.05〕。

3 讨 论

Fischer大鼠甲状腺细胞具备甲状腺细胞大部分特征及生理功能，如碘化酪氨酸、甲状腺过氧化物酶及甲状腺球蛋白等，并且具有碘/钠转运体，但无法构成甲状腺组织中的滤泡结构，也无法在培养基中生成游离的甲状腺素及三碘甲腺原氨酸等物质〔3〕。有研究表明〔4〕，在狗和人的甲状腺结构中，低剂量或中等剂量的碘可对一系列促甲状腺素介导的甲状腺效应产生阻滞作用，如碘/钠转运体及甲状腺过氧化物酶的表达、环磷酸腺苷的合成等。碘含量过高会对甲状腺球蛋白碘化产生干扰作用，进而使甲状腺激素的合成过程发生中断〔5〕。

在正常情况下，甲状腺组织能够生成过氧化氢，并使之合成甲状腺激素。就生成部位而言，产生H2O2的重要来源为内质网和线粒体生成的超氧阴离子〔6〕。本研究中，采用0.1 mmol/L碘化钾处理2 h时，Fischer大鼠甲状腺细胞中线粒体超氧化物指示剂荧光强度显著增加，表明细胞中生成了大量超氧化物，并且发生线粒体过氧化损伤。而处理6 h及1 d后，指示剂荧光强度仍高于对照组，表明在过量碘化钾的不断刺激处理下，Fischer大鼠甲状腺细胞中线粒体超氧化物生成持续增加，并且继续氧化损伤线粒体。其主要原因可能为：(1)通过cAMP通路，碘对甲状腺细胞发挥刺激性作用，进而生成H2O2；(2)碘量过高时，H2O2消耗量降低，引发活性氧蓄积〔7，8〕。由于生成H2O2，甲状腺过氧化物酶发生氧化，形成氧化复合物Ⅰ(CPDI)，该物质可接受一个电子形成复合物Ⅱ，进而生成一个自由基，形成一个氧化-还原循环过程。该循环过程必须精确、稳定，当氧化趋势增强时，则会形成游离的H2O2、超氧阴离子及过氧化脂肪酸等；当碘量异常增加时，则会对催化样活性发生抑制，从而生成大量自由基，并且会导致甲状腺细胞中聚集大量以氧化形式存在的碘，此类物质如果过多潴留在甲状腺细胞中会对微粒体、线粒体及细胞膜造成严重损伤，破坏甲状腺组织的正常功能，严重者会引发甲状腺萎缩。

本研究结果表明，在早期经高碘处理可导致Fischer大鼠甲状腺细胞线粒体发生氧化损伤，破坏线粒体膜的完整性，并且有细胞色素C释放至细胞质，随着处理时间的增加，细胞膜被破坏程度不断增加，最终会导致细胞发生坏死及凋亡。有研究资料指出〔9〕，凋亡机制的开关为线粒体，线粒体不仅是损伤效应的靶点，同时也是生成活性氧的重要部位。线粒体呼吸链可生成细胞中大量活性氧，活性氧可对DNA、脂质及线粒体蛋白直接发挥作用，进而影响其正常生理功能。心磷脂过氧化等多种脂质过氧化反应是引发凋亡关键性事件发生的重要因素。

1杨 宇，吴敏范，梁 宇，等.异钩藤碱对多发性抽动症模型大鼠头部抽动行为与脑内单胺递质水平的影响〔J〕.中华行为医学与脑科学杂志，2016；25(1)：29-33.

2葛东宇，李春盈，姚小芹，等.清金化痰汤对 COPD 模型大鼠肺组织中性粒细胞弹性蛋白酶及黏蛋白5AC 表达的影响〔J〕.吉林中医药，2016；33(1)：65-71.

3王涤非，李国姣，董玉梅，等.间歇性高糖对大鼠胰岛细胞瘤细胞系Ins-1的损伤作用及对第10号染色体缺失的张力同源性磷酸酶表达的影响〔J〕.中华糖尿病杂志，2015；7(11)：689-93.

4Hosseini-Zijoud SM,Ebadi SA,Goodarzi MT,etal.Lipid peroxidation and antioxidant status in patients with medullary thyroid carcinoma:a case-control study〔J〕.J Clin Diagn Res,2016；10(2):BC04.

5杨国庆，韩为东，母义明，等.骨髓间充质干细胞对糖脂毒性诱导的大鼠胰岛素瘤细胞损伤的保护作用〔J〕.中华糖尿病杂志，2015；7(5)：316-20.

6薛富善，崔昕龙，王世玉，等.不同浓度PNU282987对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响〔J〕.中华麻醉学杂志，2015;35(7)：790-3.

7王世英，时 军，陈宝平.活性维生素D对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的抑制效果及其可能机制〔J〕.中国老年学杂志，2015;35(20)：5700-2.

8敖强国，王晓华，程庆砾，等.糖尿病大鼠肾小管间质早期病变及肾康注射液的干预治疗〔J〕.中华医学杂志，2015;95(4)：289-93.

9马军建，王燕玲，王俊玲，等.甲状腺功能减退对雄性大鼠睾丸c-fos和c-jun基因mRNA表达的影响〔J〕.中华地方病学杂志，2016;36(1)：27-31.

〔2017-03-11修回〕

(编辑 袁左鸣/滕欣航)

R965.1

A

1005-9202(2017)18-4476-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.019

广东省卫生厅资助项目(No.WSTJJ20121204)；深圳市坪山新区医疗卫生发展孵化资助资金课题(No.201333)

包建忠(1974-)，男，主管药师，主要从事药学研究。