康秀文，石远峰，谢永鹏，陈晓兵，李小民

康秀文，石远峰，谢永鹏，陈晓兵，李小民

目的探讨腹腔感染致脓毒症患者外周血血清淀粉样蛋白 A（ serum amyloid A protein，SAA）、程序性细胞死亡因子-1（programmed cell death-1, PD-1）、及 CD4+、CD8+T细胞的表达。方法选择2014-01至2015-12连云港市某人民医院重症监护病房（intensive care unit, ICU）收治的37例腹腔感染致脓毒症患者为研究对象，根据病情分为脓毒症组（20例）和严重脓毒症休克组（17例），另选18名健康人作为对照组。患者在起病入科时抽取外周血，采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunoassay，ELISA）检测SAA、PD-1的浓度，流式细胞仪检测外周血T细胞亚群CD+、4的表达。结果与健康对照组比，脓毒症组、严重脓毒症及休克组外周血SAA浓度升高，PD-1浓度降低，T细胞比率、比值升高T细胞比率降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与脓毒症组相比，严重脓毒症及休克组外周血SAA浓度更高，PD-1浓度更低，细胞比率、比值更高，CD8+T细胞比率更低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论外周血SAA、PD-1及T细胞可作为腹腔感染致脓毒症患者病情的监测指标，且病情越重数值变化越大。

腹腔感染；脓毒症；血清淀粉样蛋白A；程序性细胞死亡因子-1

脓毒症是指由感染导致的宿主全身炎性反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），免疫功能障碍是引起脓毒症患者病死的主要原因[1]。血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A protein，SAA）是反映早期炎性反应的敏感指标，研究表明，SAA是一个新的具有诊断及鉴别诊断意义的炎性反应和脓毒症指标[2]。程序性细胞死亡因子-1（programmed cell death-1，PD-1）是一种共刺激分子，参与机体免疫应答。近几年，基于PD-1的免疫疗法成为肿瘤治疗研究领域中最为活跃的部分，但PD-1在脓毒症中的研究较少，有研究显示，PD-1可加剧脓毒症免疫反应[3]。本研究旨在探讨腹腔感染致脓毒症患者外周血SAA、PD-1及T细胞的表达，以期在临床上找到脓毒症病情新的监测指标，指导临床治疗。

1 对象与方法

1.1对象 选择2014-01至2015-12 连云港市某人民医院重症监护病房（intensive care unit, ICU）收治的腹腔感染致脓毒症患者37 例作为研究对象，依据病情分为脓毒症组（20例）和严重脓毒症休克组（17例），其中男21例，女16例，年龄20～81岁，平均（55.76±13.87）岁；病因：消化道穿孔致腹腔感染11例，外伤致腹腔感染14例，术后肠瘘12例；另选18例健康者作为健康对照组，其中男8例，女10例，年龄22～76岁，平均（52.76±11.09）岁。

1.2纳入与排除标准 纳入标准：脓毒症诊断标准参照2001年危重病医学会、欧州危重病医学会、美国胸科医师协会、美国胸科学会、外科感染学会关于全身性感染定义国际会议所制定的脓毒症诊断标准（ACCP/ SCCM2001）进行确诊。排除标准：（1）年龄＜18岁；（2）患有自身免疫性疾病者；（3）免疫缺陷性疾病者；（4）肿瘤患者；（5）近期接受免疫抑制药治疗者；（6）终末期疾病患者；（7）血液净化者。

1.3检测指标 健康对照组随机抽取外周血2管，入组患者在起病入科时抽取外周血2管，各2 ml，用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝，一管3500 r/min离心10 min，取血清采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunoassay，ELISA）检测SAA、PD-1浓度，人SAA、PD-1 ELISA试剂盒（DY1086）购自美国R＆D公司；另一管采用流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司）检测CD4+、CD8+、CD4+/CD8+T细胞的表达。

T细胞亚群CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS试剂（货号：Z6410001）购自美国Beckman-Coulter公司。

1.4统计学处理 采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理。计量资料采用表示，多组间比较采用oneway ANOVA，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1外周血SAA表达量 3组外周血SAA的浓度差异有统计学意义（F=575.654，P＜0.05）。进一步两两比较结果显示，与健康对照组相比，脓毒症组、严重脓毒症休克组外周血SAA浓度显著升高（P＜0.05）；与脓毒症组相比，严重脓毒症休克组外周血SAA浓度更高，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.2外周血PD-1表达量 三组外周血PD-1的表达量差异有统计学意义（F=985.896，P＜0.05）。进一步两两比较结果显示，与健康对照组相比，脓毒症组、严重脓毒症休克组外周血PD-1浓度显著降低（P＜0.05）；与脓毒症组相比，严重脓毒症休克组外周血PD-1浓度更低，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.3外周血细胞比率、细胞比率、比值 三组外周血CD4

+T细胞比率（F=123.804，P＜0.05）、CD8+T细 胞 比 率（F=231.246，P＜0.05）、CD4+/CD8+比值（F=337.701，P＜0.05）的比较，差异均有统计学意义。进一步两两比较结果显示，与健康对照组相比，脓毒症组、严重脓毒症及休克组外周血清CD4+T细胞比率、CD4+/CD8+比值显著升高，CD8+T细胞比率显著降低（P＜0.05）；与脓毒症组相比，严重脓毒症休克组外周血清CD4+T细胞比率、CD4+/CD8+比值更高，CD8+T细胞比率更低，差异均有统计学意义（P＜0.05，表1）。

3 讨 论

脓毒症患者机体促炎与抗炎机制的紊乱最终导致免疫失衡，进而造成其免疫功能低下。过度激活的炎性反应及伴随的免疫功能抑制均会造成心血管系统、呼吸系统、泌尿系统等多器官组织的严重功能损伤进而导致患者死亡[1]。

SAA是一种急性时相反应蛋白，有4种亚型，其中SAA1和SAA2参与急性炎性反应。在急性时相反应中，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，合成过程主要受白介素-1（interleukin-1，IL-1）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）调节，单独的白介素-6（interleukin- 6，IL-6）对于SAA合成影响不大[4]，但是IL-6与IL-1、TNF-α协同刺激时，SAA则大量表达，可升高到最初浓度的100～1000倍[5]。Arnon等[6]发现SAA在脓毒症发生时即可升高，8 h后达峰值，阴性预测值达100%；文献[2]报道SAA是一个新的具有诊断及鉴别诊断意义的炎性反应和脓毒症指标，meta分析揭示，SAA用于诊断新生儿脓毒症的准确度适中，可作为新生儿脓毒症的诊断指标[7]。本研究发现，与健康对照组比，脓毒症组、严重脓毒症休克组外周血SAA浓度升高，且严重脓毒症休克组较脓毒症组浓度更高，提示对于腹腔感染致脓毒症患者SAA可作为早期诊断指标。

表1 健康对照组与两组腹腔感染致脓毒症患者外周血清SAA、PD-1表达量及T细胞比率、T细胞比率、比值的比较 （x±s）

表1 健康对照组与两组腹腔感染致脓毒症患者外周血清SAA、PD-1表达量及T细胞比率、T细胞比率、比值的比较 （x±s）

注：SAA，血清淀粉样蛋白A ；PD-1，程序性细胞死亡因子-1；与健康对照组相比，①P＜0.05；与脓毒症组相比，②P＜0.05

组别 SAA表达量（mg/L） PD-1表达量（ng/ml） CD4+T细胞（%） CD8+T细胞（%） CD4+/CD8+健康对照组（n=18） 5.47±2.72 90.52±3.12 42.32±1.85 26.64±1.23 1.59±0.11脓毒症组（n=20） 25.07±11.35① 73.85±2.66① 46.51±1.08① 21.98±0.82① 2.12±0.08①脓毒症休克组（n=17） 37.76±13.30①② 52.85±1.32①② 49.23±0.74①② 18.54±1.30①② 2.67±0.16①②

PD-1属于CD28/CTLA-4家庭，存在两个配体，即程序性细胞死亡因子配体1和2（programmed cell death ligand 1 and 2, PD-L1 and PD-L2）。PD-L1广泛表达于T细胞、B细胞等淋巴细胞及非淋巴细胞，如心脏内皮细胞、胰腺细胞等，PD-1与PD- L1结合后通过抑制T、B细胞活性来维持正常机体免疫功能，防止自身性免疫疾病的发生；PD-L2主要参与调控自然环境抗原引起的免疫反应，通过募集激活蛋白酪氨酸磷酸酶，对T细胞免疫起到负性调节作用[8]。因此，在调节免疫方面PD-1/PD-L1发挥主要作用。T细胞免疫在人体免疫系统中居重要地位[9]，CD4+T细胞在细胞免疫反应阶段可产生多种细胞因子，促进炎性反应，CD8+T细胞可直接杀死细胞或相应靶细胞的特异性抗原，清除毒性物质，CD4

+/CD8

+比值是反应机体免疫功能的重要指标[10]，该比值降低表示细胞免疫功能受到抑制。

近几年，基于PD-1的药物和技术研究中最为活跃的是肿瘤治疗领域，多项研究显示，应用抗PD-1抗体对多位癌症患者进行治疗，发现封锁PD-1/PD-L1途径可以增强免疫反应，进而导致肿瘤细胞死亡[11-13]。然而，目前PD-1在脓毒症中的研究较少，动物研究发现抗PD-Ll抗体可阻断PD-1/PD-L1信号途径，降低caspase -8和caspase-9在T细胞活性[14,15]。Gao等[3]研究发现，PD-1在脓毒症患者中促进T细胞耗尽，加剧免疫紊乱。而目前国内外对于腹腔感染所致脓毒症目前尚无研究，因此，阻断PD-1/PD-L1传导途径可能成为腹腔感染致脓毒症患者临床治疗中的一个突破。

本研究显示，相对于健康对照组，脓毒症组、严重脓毒症休克组在发病时，PD-1浓度均明显降低，而且严重脓毒症休克组较脓毒症组更低，提示脓毒症早期，PD-1与受体结合后通过抑制T、B细胞活性，造成机体免疫失衡，而且病情越重，免疫失衡越重。另外，与健康对照组相比，脓毒症组、严重脓毒症休克组在发病时CD4+比例上升，CD8+比例下降，CD4+/ CD8+比值升高，且严重脓毒症休克组较脓毒症组比例变化更大，提示脓毒症早期CD4+T细胞增多，进而可以产生多种细胞因子，加重炎性反应，相反CD8+T细胞下降，造成机体清除毒性物质能力下降，加之PD-1抑制T、B细胞活性，最终导致炎性反应与免疫失衡。

总之，外周血SAA、PD-1及CD4+、CD8

+T细胞可作为腹腔感染致脓毒症患者病情的监测指标，且病情越重数值变化越大，这可能对腹腔感染所致脓毒症患者诊治提供一定指导。本课题样本量小，原发病不一致，严重脓毒症休克组部分患者发病初期并发其他脏器损伤，均可影响试验结果，而且目前对腹腔感染致脓毒症患者外周血PD-1的表达研究还很少，相关研究需进一步深入。

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（2016-11-04收稿2016-11-28修回）

（责任编辑 付 辉）

Expression of SAA, PD-1, CD4+and CD8+T cells in peripheral blood of patients with sepsis caused by abdominal infections

KANG Xiuwen, SHI Yuanfeng, XIE Yongpeng, CHEN Xiaobing, and LI Xiaomin. Intensive Care Unit, The First People's Hospital of Lianyungang City Affiliated to Xuzhou Medical University, Lianyungang 222002, China
Corresponding author: LI Xiaomin, E-mail: lyglxm1@163.com

ObjectiveThe aim of this study is to investigate the expression of serum amyloid A protein (SAA), programmed cell death-1 (PD-1), CD4+and CD8+T cells in peripheral blood of patients with sepsis caused by abdominal infections.MethodsA total of 37 sepsis patients caused by abdominal infections in the intensive care unit (ICU) of a people's hospital of Lianyungang city from January 2014 to December 2015 were selected as research subjects, and divided into sepsis groups (20 cases) and severe sepsis or shock group (17 cases) according to severity of the condition. Another 18 healthy persons were selected as control group. Peripheral blood of patients were sampled when admitted into hospital. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method was used to detect the concentration of SAA and PD-1. Flow cytometry instrument was used to detect the expression oandT cells.ResultsCompared with the control group, in sepsis group and severe sepsis or shock group, concentration of SAA were increased, concentration of PD-1 were decreased, proportion of CD+4were increased, proportion ofwas decreased, the ratio ofwere increased, the differences were statistically significant (P＜0.05); Compared with the sepsis group, in severe sepsis or shock group, concentration of SAA was higher, concentration of PD-1 was lower, proportion ofwas higher, proportion ofwas lower, ratio ofwas higher, the differences were statistically significant (P＜0.05).ConclusionsThe expression of SAA and PD-1, andT cells in peripheral blood can be used as the monitoring indexes of sepsis patients caused by abdominal infections. The severer the condition, the bigger the changes.

abdominal infections; sepsis; serum amyloid A protein; programmed cell death-1

R631

10.13919/j.issn.2095-6274.2016.12.004

康秀文，硕士，主治医师，E-mail：mafei8922@163.com

222002，徐州医科大学附属连云港市第一人民医院ICU

李小民，E-mail：lyglxm1@163.com