尹世金, 陈 璇, 闻闫瀚, 陆春兰, 胡青兰,邹 艳,张 丰, 王 冠, 黄 鑫,黄 谨

(1中南民族大学 药学院，武汉430074；2中南民族大学 生物医学工程学院，武汉430074)

少棘蜈蚣钾通道毒素多肽KTX-Ssm175的表达、纯化与鉴定

尹世金1, 陈 璇1, 闻闫瀚1, 陆春兰2, 胡青兰1,邹 艳1,张 丰1, 王 冠1, 黄 鑫1,黄 谨1

(1中南民族大学 药学院，武汉430074；2中南民族大学 生物医学工程学院，武汉430074)

采用Illumina II代转录组测序技术构建了湖北少棘蜈蚣毒腺转录组数据库，从中筛选到一个全新的毒素多肽编码基因KTX-Ssm175.经序列比对显示KTX-Ssm175多肽与κ-SLPTX-Ssm1a高度同源，提示KTX-Ssm175多肽为一种新的电压门控性钾通道阻断剂.采用基因工程技术构建了pGEX-4T-1-KTX-Ssm175原核表达载体，通过GST融合蛋白表达法对KTX-Ssm175多肽在大肠杆菌Rosetta中进行诱导表达和分离纯化.MALDI-TOF-MS质谱测定显示纯化的KTX-Ssm175多肽分子量与理论值相吻合，说明成功实现了KTX-Ssm175多肽的基因工程制备，为深入研究其结构与功能提供了物质基础.

少棘蜈蚣；转录组；KTX-Ssm175；钾通道阻断剂；基因工程

作为一大类跨膜蛋白家族，离子通道选择性介导带电离子进出细胞而维持细胞正常的膜电位水平和离子浓度，参与机体多种重要的病理生理过程[1].随着基因敲出技术的广泛运用，越来越多的离子通道蛋白功能得以阐明，并直接证明多种疾病的发生与离子通道蛋白结构和功能异常密切相关[2].但由于动物体本身具有代偿机制，当选择性敲出某个离子通道蛋白编码基因时，机体会通过调节其他具有类似功能的蛋白表达水平作为补偿，进而可能掩盖被敲出的离子通道蛋白功能[3]，所以高选择性阻断离子通道蛋白的生物活性多肽仍然是阐明某些通道蛋白结构和功能的重要分子工具[4].此外，靶向离子通道的生物活性多肽往往也是具有潜在药用价值的先导化合物[5].

继蝎子[6]、蜘蛛[7]、芋螺[8]等有毒动物之后，近期研究表明蜈蚣毒腺是发现离子通道调节肽的重要资源库.赖韧等[9]直接从江苏少棘蜈蚣毒液中分离了多种离子通道调节肽，并进行了功能鉴定，其中μ-SLPTX-Ssm6a能够阻断哺乳动物Nav1.7型钠通道，产生了优于吗啡的镇痛效应[10]；Rh Tx降低热激活阈值激活TRPV1通道的门控机制，开启了一条崭新的控制痛觉感受器途径[11]；阻断哺乳动物钾通道的κ-SLPTX-Ssm1a，能够产生较强的杀昆虫活性[9].对于能够实行大规模养殖的蜈蚣，如少棘蜈蚣，其毒液中高丰度表达的活性多肽可以直接分离提取[9,10,11]，然而对于低丰度表达的蜈蚣毒素多肽，尤其是对于不能大规模养殖的蜈蚣，直接从蜈蚣毒液中提取离子通道调节肽必然受限，而联合使用现代转录组测序和基因工程制备技术，能有效克服这一弊端.

本研究通过对湖北少棘蜈蚣毒腺进行转录组测序，发现了一条新的蜈蚣毒素多肽编码基因KTX-Ssm175，其成熟肽与另一蜈蚣毒素多肽κ-SLPTX-Ssm1a存在三个氨基酸残基的差异，既然KTX-Ssm175多肽未曾在以往的蛋白质组学研究中报道，提示其可能是一低丰度表达的多肽，不易直接从蜈蚣毒液中分离提取.本研究拟采用外源基因的原核表达技术，对KTX-Ssm175进行表达纯化，以期实现蜈蚣源性离子通道调节肽的常规基因工程制备，提高蜈蚣源性离子通道调节肽的挖掘效率，也为进一步深入研究KTX-Ssm175多肽的结构与功能提供物质基础.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

pGEX-4T-1、实验菌株DH5α、E.coli/Rosetta(DE3)等为本实验室保存.限制性内切酶BamH I、NdeI和XhoI、PCR所用pfu酶、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自Takara公司；T4DNA连接酶、DNA Marker、PCR产物回收试剂盒购自Fermentas公司；PCR引物由武汉天一辉远合成；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒、还原型谷胱甘肽GSH和氧化性谷胱甘肽GSH购自武汉众一生物技术公司；小肠激酶(Enterokinase, EK)购自武汉摩尔生物公司，小分量蛋白Marker购自武汉丁香园科技有限公司；10 KD、3 KD截留超滤管购自Milipore公司；其他试剂均为国产分析纯.

1.2 pGEX-4T-1-KTX-Ssm175重组表达载体的构建

根据KTX-Ssm175的编码序列分别设计4条overlap PCR引物：KTX-Ssm175-FP1，5′CTGGGATCCGATGACGATGACAAGACCGATGATAAAAGCAGCAACAAATGCGCGAAAA3′，单划线为BamH I酶切位点，双下划线为编码EK酶酶切位点的核酸序列；KTX-Ssm175 -FP2，5′ACAAATGCGCGAAAACCAAACGCCGCGAAGATGTGTGCCGCGT GTGCGGCAACCGCAG3′；KTXSsm175-RP2，5′ATAATCGCTTTCGCAGCATTCGCTATAATATTC ATCGTTGCCGCTGCGGTTGCCGCAC3′；KTXSsm175-RP1，5′CCGCTCGAGTCAGTT GCGCAGCAGATCCAGGCAGCGTTCATAGCGATAATCGCTTTCGCA3′，单划线为XhoI酶切位点.

PCR反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，72℃终延伸2 min，28次循环.PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR产物回收试剂盒回收纯化.将纯化的质粒pGEX-4T-1和KTX-Ssm175用BamH I和XhoI双酶切后连接过夜.将连接产物转化入DH5α感受态细菌中.挑取阳性克隆子，进行PCR鉴定并进行序列测定.

1.3 KTX-Ssm175多肽的表达、纯化与质谱鉴定

将测序正确的KTX-Ssm175重组子转化入表达菌种E.coli/Rosetta(DE3)中.挑取的阳性菌株于含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600=0.6～0.8时，加入终浓度为1 mM的IPTG进行诱导，28℃培养4 h，离心收集菌体，超声破碎，离心取上清液，采用GSH亲和层析法对GST-KTX-Ssm175融合蛋白进行分离，分离后的融合蛋白用EK酶酶切，对酶切产物采用RP-HPLC技术进行目的蛋白的分离纯化.在纯化过程中取样进行Tricine系统的SDS-PAGE电泳，纯化后的KTX-Ssm175多肽使用MALDI-TOF-MS技术精确测量其分子量.

2 结果

2.1 KTX-Ssm175的一级结构特征分析

KTX-Ssm175的编码基因信息由本验室构建的湖北少棘蜈蚣转录组测序数据库中获得.KTX-Ssm175的先导cDNA序列全长402 bp，由5′未翻译区(5′UTR)、开放阅读框(ORF)和3′未翻译区(3′UTR)三部分组成，其中5′UTR长31 bp，3′UTR长146 bp，在3′UTR区多聚腺苷酸尾巴上游33 bp处可发现AATAAA加尾信号(图1a).ORF编码74个氨基酸残基的前肽，SignalPV3.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/在线预测提示KTX-Ssm175前肽中含有23个氨基酸残基构成的信号肽，紧跟其后的是由51个氨基酸残基构成的成熟肽，成熟肽通过六个半胱氨酸形成的三对二硫键维持空间结构.同源序列比对分析发现，KTX-Ssm175多肽一级结构与已报道的蜈蚣毒素多肽κ-SLPTX-Ssm1a具有94.12%的相似性(图1b)，提示KTX-Ssm175可能具有阻断哺乳动物初级感觉神经元电压门控性钾通道的生物学功能[9].

单下划线：信号肽；双下划线：加尾信号aataaa；灰色背景字：半胱氨酸残基；数字：氨基酸残基位次；灰色字体：差异氨基酸残基图1 KTX-Ssm175的cDNA和氨基酸序列(a)及其与κ-SLPTX-Ssm1a成熟肽序列比对结果(b)Fig.1 cDNA and amino acids sequence of KTX-Ssm175(a) and sequence alignments of peptide KTX-Ssm175 with κ-SLPTX-Ssm1a(b)

2.2 pGEX-4T-1-KTX-Ssm175原核表达载体的构建

本研究室以往采用pGEX-4T-1质粒为表达载体，成功实现了蜈蚣源性活性多肽的基因工程制备[12]，与课题组以往研究方法类似，本研究采用BamH I和XhoI内切酶将KTX-Ssm175编码基因插入到pGEX-4T-1质粒GST编码基因下游的多克隆位点中，构建了pGEX-4T-1-KTX-Ssm175原核表达载体(图2a).通过两轮的overlap PCR扩增得到KTX-Ssm175的全长片段，琼脂糖凝胶电泳检测可见约200 bp的亮带，与理论碱基数值相符(图2b).对PCR产物和PGEX-4T-1质粒进行BamH I和XhoI双酶切连接转化后，获得了转化有PGEX-4T-1-KTX-Ssm175重组质粒的Rosetta阳性菌落，阳性菌提取质粒后进行BamH I和XhoI双酶切，也获得了约200 bp的DNA片段(图2c)，DNA测序证明重组的原核表达载体PGEX-4T-1-KTX-Ssm175构建成功，可用于GST-KTX-Ssm175融合蛋白的诱导表达.

BamH I和Xho I之间为KTX-Ssm175的基因插入位点a) pGEX-4T-1-KTX-Ssm175载体的构建

M)marker；1)KTX-Ssm175 b)KTX-Ssm175基因扩增产物

M) marker；1) 双酶切后目的基因和PGEX-4T-1载体；2)阳性对照c)pGEX-4T-1-KTX-Ssm175的BamH I和Xho I双酶切结果 图2 pGEX-4T-1-KTX-Ssm175载体的构建和质粒双酶切鉴定Fig.2 Construction of pGEX-4T-1-KTX-Ssm175 vectors and plasmid identification by double enzyme digestion

2.3 GST-KTX-Ssm175融合蛋白诱导表达条件的优化

根据文献[13]报道，28℃下将Rosetta基因工程菌培养到OD600值介于0.6～0.8时，通过改变加入的IPTG浓度和诱导时程来优化GST-KTX-Ssm175融合蛋白表达条件.在28℃、 IPTG浓度为1.0 mM时，一定时程内随着诱导时间的延长，多肽表达产量逐渐升高，当延长到4 h后达到较为理想的效果，此后再延长诱导时间，目的蛋白表达量并无显著提高(图3a).在28℃诱导4 h的固定条件下，进一步比较不同浓度IPTG诱导剂对GST-KTX-Ssm175融合蛋白表达产量的影响，结果发现0.5, 1.0, 1.5 mmol/L 浓度的IPTG均达到比较理想的诱导效果(图3b)，为保证目的蛋白能够得以稳定诱导，本研究选用1.0 mM 中间浓度的IPTG、28℃诱导4 h后收获诱导菌体进行目的蛋白的分离纯化和鉴定.

2.4 KTX-Ssm175多肽的制备和鉴定

将pGEX-4T-1-KTX-Ssm175重组载体转化大肠杆菌Rosetta，依据本研究优化的条件进行蛋白诱导表达，经GSH亲和层析、超滤脱盐并浓缩后，获得GST-KTX-Ssm175融合蛋白，用EK酶酶切后，在SDS-PAGE电泳图上显示两条主要的条带，一条为26 KD的GST，另一条约6 KD条带可能为KTX-Ssm175多肽(图4a第4泳道).将EK酶酶切后的蛋白混合物经RP-HPLC的C18柱分离纯化，采用50 min的溶液梯度线性洗脱，在190 nm的紫外波长下检测显示，在32 min稳定出现的峰应该为GST所在位置(根据以往的文献报道推断)，而在之前14 ～15 min时段出现了3个峰，这3个峰之一可能为目的蛋白KTX-Ssm175多肽所在位置(图4b).收集14 min和15 min时段出现的两个主峰A和B对应的蛋白，SDS-PAGE电泳显示A蛋白分子量要略高于B蛋白(图4a第5和第6泳道).经MALDI-TOF-MS分子质量测定，发现A蛋白分子量为6041.7(图4c)，B蛋白分子量为5298.5，而KTX-Ssm175多肽的分子量理论值为6041.6，表明A蛋白就是KTX-Ssm175多肽.实验结果提示：在采用GST亲和层析法进行KTX-Ssm175多肽的基因工程制备时，应高度重视RP-HPLC分离纯化过程混杂蛋白对KTX-Ssm175多肽的干扰，需重点收集14 ～15 min时段出现的第1个主峰所对应的蛋白样品.

a)纯化的KTX-Ssm175多肽SDS-PAGE电泳分析：M为标准蛋白Marker，1为未诱导蛋白，2为诱导4 h后的蛋白，3为纯化并超滤脱盐后浓缩的GST-KTX-Ssm175，4为GST-KTX-Ssm175融合蛋白EK酶酶切后的混合物，5为RP-HPLC在15 min分离出的产物，6为RP-HPLC在14 min分离出的产物；b)KTX-Ssm175多肽的RP-HPLC纯化结果：A为14 min的出锋图，B为15 min的出锋图；c)KTX-Ssm175多肽的MALDI- TOF-MS质谱分析图4 KTX-Ssm175多肽的制备和鉴定Fig.4 Preparation and identification of polypeptide KTX-Ssm175

3 讨论

目前获得有毒动物来源的生物活性多肽主要有三种途径，直接从有毒动物分泌的毒液中分离[9,10]、人工合成[11]和基因工程制备[14].如果有毒动物的毒液易于获取，且生物活性多肽表达丰度高，就可以直接从有毒动物的毒液中提取分离；如果生物活性多肽结构不复杂，含二硫键少，就可以根据生物活性多肽氨基酸残基顺序进行人工合成.利用真核或者原核表达系统，对生物活性多肽进行基因工程制备，则不受上述条件的限制，是目前获得有毒动物源性离子通道调节肽的主要方式.越来越多的研究表明蜈蚣毒腺分泌了多种类型的离子通道调节肽[15]，这些鉴定了功能的蜈蚣毒素多肽大多直接从蜈蚣毒液中分离提取[9,10,11]，由于受动物毒液来源限制，这些离子通道调节肽多来自大规模养殖的少棘蜈蚣.相比于蝎子[14]、蜘蛛[7]等有毒动物来源的离子通道调节肽，蜈蚣源性离子通道调节肽的基因工程制备相对滞后.

本研究从湖北少棘蜈蚣毒腺转录组数据库中发现了一条新的蜈蚣毒素多肽编码基因KTX-Ssm175，该基因编码的成熟肽与已报到的另一蜈蚣毒素多肽k-SLPTX-Ssm1a高度同源(图1b)，均含有51个氨基酸残基和三对二硫键，二者仅存在三个氨基酸残基的差异，提示KTX-Ssm175可能是一个钾离子通道调节肽[9].对应于κ-SLPTX-Ssm1a多肽N末端第4位的谷氨酸、第17位的天冬酰胺和第43位的组氨酸，KTX-Ssm175依次为赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸，二者的差异均体现在带电荷氨基酸残基上，而带电荷氨基酸残基引起的静电相互作用是毒素多肽识别离子通道的主要分子间作用力[16]，提示KTX-Ssm175与κ-SLPTX-Ssm1a在调节离子通道功能上可能存在一定的差异.KTX-Ssm175多肽的编码基因是从湖北少棘蜈蚣毒腺转录组数据中获得，无论是编码基因还是成熟肽信息均未在以往的文献中报道，提示KTX-Ssm175在少棘蜈蚣毒腺中可能呈低丰度表达状态.

因此，本研究采用本室以往的蝎毒素多肽原核表达技术[13]，通过基因工程的方法构建了PGEX-4T-1-KTX-Ssm175表达载体，在基因工程菌Rosseta中实现了GST-KTX-Ssm175融合蛋白诱导表达条件的优化，融合蛋白经EK酶酶切后在RP-HPLC系统中进行了KTX-Ssm175多肽的分离，并经MALDI-TOF-MS成功鉴定了KTX-Ssm175多肽的分子量.与以往蝎毒素多肽基因工程制备结果有所不同，GST-KTX-Ssm175融合蛋白在进行EK酶酶切后，经RP-HPLC系统分离出了多个组分(图4b)，MALDI-TOF-MS质谱鉴定表明，仅有其中一个组分的分子量与KTX-Ssm175多肽的理论值相吻合(图4b)，另一组分的分子量要略微小于KTX-Ssm175多肽理论值，可能是由于EK酶对GST-KTX-Ssm175融合蛋白产生了非特异性切割，或本研究的表达条件不够理想，还需要不断优化.总之，本研究为实现蜈蚣源性离子通道调节肽的基因工程制备提供了重要的技术参考，也为深入研究KTX-Ssm175多肽的结构与功能奠定了物质基础.

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Expression, Purification and Identification of Potassium Channel Toxins KTX-Ssm175 fromScoropendrasubspinipesmutilans

Yin Shijin1, Chen Xuan1,Wen Yanhan1, Lu Chunlan2, Hu Qinglan1, Zou Yan1,ZhangFeng1,WangGuan1,HuangXing1,HuangJin1

(1 College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074，China;2 College of Biomedical Engineering, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074，China)

A new toxin polypeptide gene ofKTX-Ssm175 was screened by constructing the venomous transcriptome database ofScolopendrasubspinipesmutilansfrom Hubei Province, using Illumina second generation transcriptome sequencing technology. Sequence alignment showed that the polypeptide of KTX-Ssm175 was highly homologous to κ-SLPTX-Ssm1a, suggesting KTX-Ssm175 polypeptide might be a novel voltage-gated potassium channel blocker. A prokaryotic expression vector pGEX-4T-1-KTX-Ssm175 was constructed by genetic engineering and KTX-Ssm175 polypeptides were expressed and purified inE.coliRosetta by GST fusion protein expression. MALDI-TOF-MS mass spectrometry showed that the molecular weight of the purified KTX-Ssm175 were consistent with the theoretical value. So genetic engineering preparation of KTX-Ssm175 polypeptide was successfully achieved, providing the material foundation for further study about its structure and function.

Scolopendrasubspinipesmutilans; transcriptome; KTX-Ssm175; potassium channel blocker; genetic engineering

2016-05-12

尹世金(1974-) ，男，教授，博士，研究方向: 电生理学与基因工程制药，E-mail: yinshijinyf@163.com

国家自然科学基金资助项目(81373379)；湖北省自然科学基金资助项目(2015CFB491)；国家级大学生创新训练项目(GCX15009)

Q812

A

1672-4321(2016)04-0043-05