李春禄,马文才,乔明明,杨欣艳,张彦明*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100；2.北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100094)

某规模化猪场伪狂犬病的诊断

李春禄1,2,马文才1,乔明明2,杨欣艳2,张彦明1*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨陵 712100；2.北京世纪元亨动物防疫技术有限公司，北京 100094)

河南平顶山某猪场母猪出现较严重的流产和产死胎现象，且50日龄～70日龄仔猪出现神经症状，根据临床表现初步诊断为伪狂犬病。为排除猪繁殖与呼吸综合征和猪瘟，进行了实验室诊断。应用ELISA方法检测发病保育猪及母猪血清的伪狂犬病病毒野毒株gE抗体，并对发病仔猪病料进行了伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的实时荧光定量PCR检测。结果显示，伪狂犬病病毒野毒抗体阳性，实时荧光定量PCR检测确定仔猪病料中PRV核酸阳性，PRRSV和CSFV核酸阴性。结合临床症状及实验室检测，确诊该猪场发生的是猪伪狂犬病。

猪伪狂犬病；酶联免疫吸附试验；实时荧光定量PCR；诊断

猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种急性传染病。猪是伪狂犬病病毒的主要宿主和储存者，除猪以外的其他动物发病后通常具有发热、奇痒及脑脊髓炎等症状，均为致死感染。仔猪和其他易感动物一旦感染该病，病死率较高[1]。PRV主要引起母猪流产、产死胎和木乃伊胎，公猪不育，新生仔猪神经症状和腹泻[2]，与猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)症状相似，极易误诊。因此，必须借助于实验室方法，才能够对该病进行确诊。

河南平顶山某规模化猪场，基础母猪存栏1 500头，种猪群每年进行4次猪伪狂犬病疫苗预防接种，初生仔猪进行滴鼻免疫，肉猪55日龄进行肌肉注射免疫1次；种猪群每年进行3次猪瘟疫苗免疫接种，断奶仔猪25日龄肌肉注射首免，60日龄加强免疫1次；猪场未进行PRRS疫苗免疫接种。2014年12月下旬，该猪场母猪突然出现较严重的流产和死胎现象，且50日龄～70日龄仔猪出现神经症状，本文将诊断结果及报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集多头发病仔猪的脑、脾、肺和淋巴结组织，6头50日龄～70日龄发病的保育猪和24头经产母猪的血清。

1.1.2 试剂 伪狂犬病病毒gE抗体检测试剂盒为法国LSI公司生产；伪狂犬病病毒gE基因实时荧光定量PCR检测试剂盒、猪繁殖与呼吸综合征病毒通用实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒、猪瘟病毒野毒株实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒等，均由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 PRV gE抗体检测结果的计算方法及判定标准 阴性对照OD值与阳性对照OD值的差大于0.6，阳性对照阻断值大于60%，则试验成立，否则试验无效，重测。 用INH%来说明检测结果，以下是计算方式。

INH%=[(阴性对照平均OD值-血清样品的OD值)/(阴性对照平均OD值)]×100

判断标准：INH%值大于45时，判断样品为PRV-gE抗体阳性；INH%值大于或等于40且小于或等于45时，判断样品可疑，必须重测；INH%值小于40时，判断样品为PRV-gE抗体阴性。

1.2.2 PRV gE基因实时荧光定量PCR检测结果判定标准 阳性对照Ct值小于或等于30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，试验结果成立，否则试验结果无效，重测。

判断标准：被检样品Ct值小于或等于30并出现特定的扩增曲线为PRV阳性；被检样品Ct值大于30且小于37并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取DNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，则判断为阳性；被检样品Ct值大于或等于37时，超过本方法检测灵敏度范围，判断为阴性；Undetermined(Un)表示未检测到荧光信号，结果判定为阴性。

1.2.3 PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测结果判定标准 阳性对照Ct值小于或等于30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，试验结果成立，否则试验结果无效，重测。

判断标准：被检样品Ct值小于或等于30并出现特定的扩增曲线为PRRSV阳性；被检样品Ct值大于30且小于37并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取RNA，扩增后进行结果判定，如仍可疑，则判断为阳性；被检样品Ct值大于或等于37时，超过本方法检测灵敏度范围，判断为阴性；Undetermined(Un)表示未检测到荧光信号，判定为阴性。

1.2.4 猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测结果判定标准 阳性对照Ct值小于或等于30并出现特定的扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特定扩增曲线，试验结果成立，否则试验结果无效，重测。

判断标准：被检样品Ct值小于或等于30并出现特定的扩增曲线为CSFV阳性；被检样品Ct值大于30且小于37并出现特定的扩增曲线，需重新取样提取RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，则判断为阳性；被检样品Ct值大于或等于37时，超过本方法检测灵敏度范围，判断为阴性；Undetermined(Un)表示未检测到荧光信号，结果判定为阴性。

2 结果

2.1 伪狂犬病病毒gE抗体检测结果

对采集的6头50日龄～70日龄发病的保育猪和24头经产母猪的血清进行了伪狂犬病病毒gE抗体的ELISA检测，结果详见表1。由表1可知，30份样品中有24份为阳性，6份为阴性；其中6份50日龄～70日龄发病保育猪样品阳性率100%，24份经产母猪样品阳性率75%。

2.2 病毒核酸检测结果

2.2.1 伪狂犬病病毒的检测 分别取3头发病仔猪的脑、脾、肺和淋巴结组织进行伪狂犬病病毒gE基因实时荧光定量PCR检测(图1和表2),3头发病仔猪的脑和内脏组织中伪狂犬病病毒gE基因检测结果为阳性。

2.2.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测 分别取3头发病仔猪的脑、脾、肺和淋巴结组织进行猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR检测，其中脾、肺和淋巴结组织混合为内脏组织(图2和表2),3头发病仔猪的脑和内脏组织的猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果为阴性。

2.2.3 猪瘟病毒的检测 分别取3头发病仔猪的脑、脾、肺和淋巴结组织进行猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测(图3和表2),3头发病仔猪的脑和内脏组织的猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测结果为阴性。

表1 伪狂犬病病毒gE抗体ELISA检测结果

Table 1 Detection results of gE antibody of pseudorabies virus by ELISA

类别Type数量Number阳性数Positive阳性率/%Positiverate保育猪Nurserypigs66100经产母猪Prolificsows241875

图1 伪狂犬病病毒gE基因实时荧光定量PCR扩增

图2 猪繁殖与呼吸综合征病毒实时荧光定量PCR扩增

图3 猪瘟病毒实时荧光定量PCR扩增

表2 猪伪狂犬病病毒gE基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测结果

Table 2 Detection results of gE gene of PRV 、porcine reproductive and respiratory syndrome virus、
classical swine fever virus by real-time PCR

样品编号Sample№组织Tissue伪狂犬病病毒PRV猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV猪瘟病毒CSFV1脑Brain+--脾、肺和淋巴结Spleen,lungsandlymphnodes+--2脑Brain+--脾、肺和淋巴结Spleen,lungsandlymphnodes+--3脑Brain+--脾、肺和淋巴结Spleen,lungsandlymphnodes+--阳性对照PositiveControl/+++阴性对照NegativeControl/---

注：“+”阳性；“-”阴性；“/”未知。

Note:"+"Positive；"-"Negative；"/"Unknown.

3 讨论

2011年至今，猪伪狂犬病又开始大范围流行，对我国养猪业的发展造成巨大经济损失[3-5]。规模化猪场普遍存在猪伪狂犬病病毒感染，阳性率为1.15%～16.98%[6]。伪狂犬病病毒在我国的猪场普遍存在，阳性率为34.1%，阳性猪场占检测猪场总数的38.6%[7]。安徽地区规模化种猪场猪伪狂犬病血清学调查显示，伪狂犬病病毒gE抗体阳性率为18.96%[8]。目前挪威、芬兰和荷兰等国已根除猪伪狂犬病，欧美等国的猪伪狂犬病也得到有效的控制[9]，而我国猪伪狂犬病并没有得到有效的控制，主要是因为毒株的变异，广西地区流行的伪狂犬病病毒与广东、湖北等地流行的毒株gE基因核苷酸同源性很高，而与国内经典毒株遗传关系较远[10]。 猪伪狂犬病与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等均可引起母猪流产和产死胎，在临床症状上很难区分，且会与猪瘟等疾病混合感染[11-12]，通过ELISA方法检测发病保育猪及母猪血清的伪狂犬病病毒gE抗体，采用实时荧光定量PCR方法进行伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒核酸检测，最终排除猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒的感染，从而确诊该场此次发生的是猪伪狂犬病。 该场猪群每年进行4次猪伪狂犬病疫苗普免，依然发生了猪伪狂犬病疫情，其可能的原因主要有：现用疫苗毒株不能有效保护流行毒株，可能是由于流行毒株的变异造成；免疫效果不切实，可能与疫苗质量不合格，疫苗的保存不当，免疫存在漏免等有关；生物安全方面存在隐患，如猪场未定期灭鼠，有较多的流浪猫或犬，引进后备猪时未能进行有效的检疫等。建议该场在保证疫苗质量及免疫操作的基础上，加强饲养管理，注意观察猪群状态，定期进行抗体及病原的监测，科学分析检测数据，准确了解猪群的状态，制定合理的免疫方案，避免盲目的免疫程序。该场猪伪狂犬病的发生也为新一代的疫苗的研发提出了新的要求。

疫苗免疫接种是控制猪伪狂犬病的有效措施，伪狂犬病病毒gE/gI/TK多基因缺失疫苗对仔猪和妊娠母猪健康状况均无影响，安全性好，免疫保护率为100%[13]。因此，必须加强对该病防控的重视程度，采取有效地净化措施。措施包括：禁止其他动物进入猪舍；定期灭鼠；实行自繁自养，严格执行引种检疫制度，对于引进的后备猪，必须检测伪狂犬病病毒野毒抗体，并隔离观察45 d，再进行第2次野毒抗体检测，对检测出的阳性猪进行生物安全处理；制定有效的疫苗免疫接种制度，对免疫接种后的猪群及时进行免疫效果检测，并且定期对猪群进行伪狂犬病病毒野毒株gE基因抗体检测，阳性者扑杀后进行生物安全处理[14]。猪伪狂犬病的净化需要长期坚持对猪场采取以免疫预防为主的综合措施，以防止猪伪狂犬病的发生。

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Diagnosis of Porcine Pseudorabies in a Large-scale Pig Farm

LI Chun-lu1,2，MA Wen-cai1，QIAO Ming-ming2，YANG Xin-yan2，ZHANG Yan-ming1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100；2.BeijingShijiYuanhengAnimalEpidemicPreventionTechnologyCo.Ltd，Beijing，100094)

Some sows appear serious abortion and stillbirth in a pig farm in Pingdingshan city Henan province，and 50-70 day old piglets appear neurological symptoms.According to the clinical manifestations,the disease was primarily diagnosed as pseudorabies.The laboratory diagnosis was done in order to exclude the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) and classical swine fever (CSF).The gE antibody in the sera to wild strain of pseudorabies virus was detected in nursery pigs and sows by ELISA，and sick piglet samples were detected for pseudorabies virus (PRV),porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and classical swine fever virus (CSFV) by real-time PCR.ELISA results showed that the pseudorabies virus antibody was positive,real-time PCR determined the pseudorabies virus nucleic acids was positive,but the nucleic acids of PRRSV and CSFV were negative in sick piglets.With a combination of clinical manifestations and laboratory tests,the definitive diagnosis was made as porcine pseudorabies in the farm.

Porcine pseudorabies; ELISA; real-time PCR; diagnosis

2016-04-18

李春禄(1979-),男,陕西宝鸡人,硕士研究生,主要从事动物疫病防控工作。*通讯作者

S852.659.1

B

1007-5038(2016)12-0118-04