朱玲云，张正学，郑龙龙，刘萍丹，毕峻龙，赵 谦，刘 佳，杨贵树，尹革芬*

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.楚雄州动物疫病预防控制中心，云南楚雄 675000)

兽医临床

山羊源伪狂犬病病毒的分离与鉴定

朱玲云1，张正学1，郑龙龙1，刘萍丹1，毕峻龙2，赵 谦1，刘 佳1，杨贵树1，尹革芬1*

(1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201；2.楚雄州动物疫病预防控制中心，云南楚雄 675000)

为确诊一例发病山羊是否感染伪狂犬病病毒，采集发病羊体的肺脏和脑组织进行伪狂犬病病毒gE基因PCR检测，并将病料接种至PK-15细胞分离病毒，以及进行小鼠感染试验和gD基因分析。结果表明，PCR检测结果PRV阳性，病料接种PK-15细胞24 h后，细胞开始出现细胞病变；将病毒感染小鼠，36 h后小鼠出现局部奇痒、死亡； gD基因序列分析发现，分离毒株与GenBank中的PRV gD基因序列同源性均在98% 以上，氨基酸同源性在99% 以上；在分离毒株 gD基因的808 bp～837 bp位置上存在缺失与变异、高变重复区。本研究成功分离获得一株羊源伪狂犬病毒，为云南省羊伪狂犬病防控和基础研究提供资料。

伪狂犬病病毒；PCR鉴定；PK-15细胞；基因分析；山羊

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)具有广泛的宿主谱，可感染多种哺乳动物，包括反刍动物、食肉动物和啮齿类动物等，可引起家畜和多种野生动物出现以发热、奇痒、呼吸和神经系统疾病。猪是主要贮存宿主和传染源，可引起母猪繁殖障碍、新生仔猪神经症状等[1]。PRV感染野生动物也多有报道。2012年某动物园美洲虎发生PRV感染，感染虎出现厌食，委顿，渴欲增加，偶见咳嗽、后肢运动迟缓等症状[2]。芮萍等[3]从多个毛皮动物养殖场不同日龄出现神经症状、腹泻或急性死亡的貂上采集脑组织，接种细胞分离到1株PRV。

羊也可感染PRV，冒银祥等[4]报道，河北省遵化市肉羊养殖场12 只羊出现精神沉郁、发热、转圈、磨牙，有时用头嘴蹭地，食欲减退等临床症状，个别羊还会出现咳嗽、腹泻症状，最后鉴定为PRV感染。2014年10月，云南省石林地区某养殖户山羊出现剧痒及脑脊髓炎等临床症状，与冒银祥报道的病例相似，病羊不断摩擦鼻镜，用蹄子蹭腹部，在地面上磨擦肛门，皮肤脱毛、水肿，甚至出血，个别羊出现磨齿，后足用力踏地，并表现间歇性烦躁不安等症状，站立不稳、震颤，甚至不能站立，大量流涎等症状，最后死亡。根据临床症状，初步怀疑为羊PRV感染，为了进一步证实临床诊断结果，进行了以下研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 40日龄、体重20 g的Balb/c小鼠12只，购自昆明医科大学。

1.1.2 样品来源 无菌采集病羊肺脏和脑组织， 病羊临床呈现体表脱毛、破皮和出血，卧地不起、四肢麻痹，临死前四肢做划水样运动、死亡时出现抽搐，死亡后角弓反张病料保存于-80℃冰箱中，以备检测使用。

1.1.3 细胞以及相关试剂 PK-15细胞购自中科院上海细胞库；DMEM、胎牛血清、双抗、胰酶为HyClone公司产品； DNA提取试剂盒为百泰克生物股份有限公司产品；自配PBS；其他化学试剂由云南农业大学动物医学教学中心传染病实验室提供。

1.1.4 引物 根据GenBank中PRV基因参考序列JQ809328.1，应用Oligo6.0软件分别设计了针对gD全基因和gE基因特异性引物，扩增产物大小分别为1 263 bp和500 bp，并送交生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，其引物序列见表1。

1.2 方法

1.2.1 病料组织提取DNA 无菌条件取脑组织和肺脏剪碎后，用组织研磨棒研碎，并用百泰克公司的组织DNA提取试剂盒提取病料总DNA。提取好的DNA用PRV gE基因特异性引物进行PCR扩增，初步检测病料中是否含有PRV。

1.2.2 病料组织匀浆接种细胞 无菌条件分别取脑组织和肺脏组织剪碎后，用组织研磨棒研碎，加入适量的细胞培养液，制成组织匀浆，置于-80℃冰箱里反复冻融3次；10 000 r/min离心10 min，取1 mL上清液加入100 μL双抗，4℃静置30 min；用0.22 μm一次性滤器过滤除菌，取800 μL组织匀浆过滤液接种至80%单层PK-15细胞(6孔板)，37 ℃感作1 h；加入含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基继续培养；逐日观察细胞病变。连续传代培养，当细胞出现细胞病变(CPE)的时间稳定时，终止传代培养，于-80℃冰箱中保存病毒培养物。

表1 PRV gD及gE基因引物序列

Table 1 gD and gE gene primer sequences of PRV

引物名称Primername引物序列(5'→3')Primersequence片段长度Fragmentlength扩增基因AmplifiedgenegD-FCCCCAGGTTCCCATACACTC1263bpgDgD-RTCATCATCGACGCCGGTACTgE-nFCCGCGGGCCGTGTTCTTTGT500bpgEgE-nRCGTGGCCGTTGTGGGTCAT

1.2.3 细胞培养物的TCID50测定 用PK-15细胞在96孔细胞培养板内进行试验，并用Reed-Muench两氏法计算分离病毒的TCID50。

1.2.4 小鼠感染 对细胞培养物进行蚀斑纯化和纯净性检测，将细胞培养物皮下注入40日龄体重相近的Balb/c小鼠体内，雌雄各半将其分为2组(A、B组)，每组小鼠6只。分房间饲养，自由采食饮水。A组小鼠腹侧皮下分3个不同部位注射200 μL病毒液，B组小鼠腹侧皮下分3个不同部位注射200 μL生理盐水作为空白对照。

1.2.5 细胞培养物提取DNA及其基因扩增及测序 取90%以上细胞病变的培养物，反复冻融3次。取200 μL置于DEPC水处理过的1.5 mL灭菌离心管中，用病毒DNA小量试剂盒提取病毒DNA。取病毒基因组DNA进行gD基因扩增时，PCR反应体系为25 μL，反应管依次加入灭菌ddH2O 10.5 μL，10×GC Enhancer 7.5 μL，dNTPs 2.0 μL，TransTaqHiFi DNA polymerase 0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，10×TransTaqHiFi buffer Ⅱ 2.5 μL，DNA 1.0 μL。gD基因扩条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸7 min。扩增产物用15 g/L的TAE琼脂糖凝胶电泳，回收扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.6 基因序列分析 采用Megaligan软件对测序结果进行序列比对，将测序序列及其推导的氨基酸序列与GenBank中已提交的猪PRV毒株的gD基因进行同源性分析比较，并利用MEGA5.2分析软件Clustal W法对该测序序列进行遗传进化树的绘制，从而进行遗传进化分析。

2 结果

2.1 病毒PCR鉴定

提取病料组织的DNA并进行PCR的扩增，经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。送检病料检测PRV gE基因，预期目的片段长度为500 bp，电泳结果大小符合目的片段长度(图1)，初步判定该山羊感染PRV。

M. DNA 标准DL 1 000;1.阴性对照；2.送检病样PCR产物

M.DNA Marker DL 1 000;1.Negative control; 2.Detected sample PCR products

图1 PRV的gE基因PCR扩增电泳图

Fig.1 PCR detection of PRV gE gene in detected sample

2.2 病毒分离鉴定

组织匀浆过滤液接种PK-15细胞，细胞在24 h开始出现圆缩、聚集，48 h开始慢慢脱落(图2)。细胞所出现的CPE变化符合PRV接种PK-15细胞的CPE变化[5]。

2.3 病毒TCID50测定

取分离株连续培养至第5代的病毒，在PK-15细胞上测定TCID50，按Reed-Muench法进行计算。经计算，本次分离的PRV分离株的TCID50为5.6×105/0.1 mL。

2.4 动物试验

注射了细胞培养物的A组小鼠在36 h时出现精神萎靡，48 h时小鼠焦躁不安，不停舔舐注射部位，腹部脱毛，出血；小鼠60 h时死亡1只，72 h时死亡4只，84 h时死亡1只。B组小鼠在试验过程

中精神正常，采食饮水正常，未发现异常症状。上述小鼠症状的描述符合PRV感染小鼠的症状[6]。

2.5 细胞培养物DNA提取及基因扩增

取90%以上病变的细胞培养物进行DNA提取，以提取物为模板，进行PCR的扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果显示，PCR扩增获得目片段，大小约为1 263 bp(图3)。判定细胞培养物中含有PRV，并将其命名为YN-S2014。

A.病料接种PK-15细胞；B.PK-15正常细胞

A.PK-15 cells inoculated with PRV material; B.Normal PK-15 cells

图2 疑似PRV感染料接种PK-15细胞

Fig.2 PK-15 cells inoculation with suspected PRV material

M.DNA 标准DL 2 000； 1.PRV gD基因；2.阴性对照

M.DNA Marker DL 2 000;1.PRV gD gene; 2.Negative control

图3 PRV的gD基因PCR扩增的物电泳图

Fig.3 Electrophoresis of PCR products of PRV gD gene

2.6 gD基因序列分析

扩增细胞培养上清中病毒gD基因，并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序测序。将获得基因序列与参考毒株基因序列进行同源性比对，结果如图4所示，分离株gD基因序列与GenBank中的PRV gD基因序列同源性均在98%以上；分离株gD基因序列在808-837 bp位置存在缺失与变异(图4)，存在高变重复区。分离株gD氨基酸序列与GenBank中的PRV gD氨基酸同源性均在98%以上。

将分离株gD基因序列与从GenBank下载的部分基因序列用MEGA5.2分析软件Clustal W法绘制遗传进化树，获得图5结果，显示分离株YN-S2014株与LY、TJ、HeN1、BJ株等猪源PRV的变异较小，属同一分支；与NYT、Kaplan、LA、Min-A、PRV-FZ的gD核苷酸序列变异率较高，属不同分支。

3 讨论

从疑似PRV的1份羊病料组织中分离鉴定了1株PRV，命名为YN-S2014株；通过PCR同时检测到gE和gD基因的存在，排除了疫苗毒株的可能性，证实本研究分离到的毒株是野毒，而非疫苗毒。云南省石林地区未曾有PRV gD基因的分析报道，本研究对gD 基因核苷酸序列绘制遗传进化树，分析结果显示，YN-S2014株与LY、QBA、TJ、HeN1、BJ株等猪源PRV株的变异较小(99%～100%)，属同一分支。目前，PRV 仍然是危害我国养猪业的主要传染病病原之一，每年造成的数以万计经济损失。但是对于PRV 的病毒演变、遗传变异等诸多方面的研究还不是非常清楚。为了能够在分子水平对PRV 进行研究分析，我们选择了1株中国毒株对其主要抗原蛋白基因gD 基因进行扩增测序，连同目前GenBank 登录的15株病毒基因序列，利用生物信息学的方法试图了解其基因变异和抗原变异的关系，以及云南省该株羊源PRV 基因结构特点情况等内容。而从氨基酸同源性看，该蛋白氨基酸同源性差异很小，说明基因中变异区-高变重复区对于蛋白质功能的实现造成的影响很小，暗示PRV 抗原具有相对的结构稳定性。

图4 测序序列同源性BLAST比对结果

Fig.4 Alignment results of sequence homology by BLAST

图5 PRV分离株gD基因的遗传进化树分析

Fig.5 Phylogenetic tree analysis of PRV gD gene

目前，云南省内尚未报道有羊感染PRV的病例。自2001年以来，四川省、河北省先后报道有羊感染PRV的病例[7-9]。该研究首次对云南省羊源PRV进行毒株分离鉴定，为后续研究及疫苗选择提供材料。对gD 基因核苷酸序列绘制遗传进化树，分析结果可以初步推测羊PRV与猪PRV毒株间变异较小，对该病的预防提供了一定理论基础。

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Isolation and Identification of PRV from Goat

ZHU Ling-yun1,ZHANG Zheng-xue1,ZHENG Long-long1, LIU Ping-dan1,BI Jun-long2, ZHAO Qian1, LIU Jia1, YANG Gui-shu1, YIN Ge-fen1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan,650201,China; 2.ChuxiongAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Chuxiong,Yunnan,675000,China)

To detect whether a goat was infected with pseudorabies, the lung and brain of the diseased sheep were collected to carry out the PCR detection of gE gene of the pseudorabies virus; and the material was inoculated into PK-15 cells to isolate the virus; as the same time,the mice infection test and gD gene analysis were made. The result of PCR showed that PRV was positive. After 24 hours of inoculation, the cells began to show cytopathic effect; the mice infected with virus showed partial itching and death after 36 hours.Furthermore,gD gene sequence analysis showed that the homology of PRV gD gene in GenBank was more than 98% and the homology of amino acid was more than 99%. The deletion and mutation of gD gene in 808 bp-837 bp locus were found in the isolates. In this study,pseudorabies virus was successfully isolated from the goat, which provided data and basic research for prevention and control of goat pseudorabies virus in Yunnan province.

Pseudorabies virus;PCR identification;PK-15 cell; gene analysis;goat

2015-10-15

国家自然科学基金地区项目(31160509)

朱玲云(1991-)，女，云南保山人，硕士研究生，主要从事动物传染病学与分子流行病学研究。 *通讯作者

S852.659.1

B

1007-5038(2016)12-0113-05