唐汉庆,王 兵,廉春容,王露瑶,黄俊杰,赵善民,莫小强,王金花

(右江民族医学院，广西百色 533000)

铁皮石斛多糖对冠心病缓慢性心律失常大鼠NO、 cGMP及Na+-K+-ATP 酶活性的影响

唐汉庆,王 兵,廉春容,王露瑶,黄俊杰,赵善民,莫小强,王金花

(右江民族医学院，广西百色 533000)

为观察铁皮石斛多糖对NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶活性及心肌细胞动作电位的影响并探讨其效应机制，将清洁级Wistar大鼠分为7组，每组10只。模型组高脂饲料及寒冷刺激6周，对照组基础饲料常态饲养。模型组第35天～第42天皮下多点注射垂体后叶素(10 μg/kg),对照组给等体积的生理盐水，每天1次。低、中、高剂量组，阿托品组和小檗碱组第35天～第42天分别灌胃铁皮石斛多糖(100、200、400 mg/kg)、静脉注射阿托品(5 mg/kg)、静脉注射小檗碱(8 mg/kg)，每天1次。第43天取材，检测血清NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶活性及心肌细胞动作电位。结果显示，与对照组比较，模型组、小檗碱组血清NO、 cGMP含量均显著升高(P<0.01)；Na+-K+-ATP酶活性显著降低(P<0.01)，APD、APD90、ERP均延长(P<0.05或P<0.01)，模型组造模后、小檗碱组给药后心率均显著降低(P<0.01)。与模型组比较，高剂量组及阿托品组NO、 cGMP含量均降低(P<0.05或P<0.01)；Na+-K+-ATP酶活性升高(P<0.05或P<0.01)，高剂量组及阿托品组APD、APD90、ERP均缩短(P<0.05或P<0.01)，高剂量组及阿托品组心率显著增高(P<0.01)。表明铁皮石斛多糖对NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶活性均有影响，与剂量有关，通过NO- GC- cGMP通路提高心率，同时也可能通过NO间接调节Na+-K+-ATP酶活性或直接调节Na+-K+-ATP酶活性而发挥作用。

铁皮石斛多糖；冠心病；缓慢性心律失常

冠心病缓慢性心律失常属于中医“惊悸”、“怔忡”范畴，辨证多属于心阳虚，重者为心肾阳虚，以滋阴增液、通经复脉的方药能取得一定的功效[1]，铁皮石斛是常用的一味名贵药材，有滋阴生津、补虚通络之功效，铁皮石斛多糖(Dendrobiumcandidumpolysaccharides，DCP)是铁皮石斛的主要成分，对冠心病缓慢性心律失常有一定改善作用[2]，关于其起效机制，有研究认为NO作为第二信使起关键作用，DCP可能是通过鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase，GC)调节环磷酸鸟苷 (cGMP) 浓度以及Na+-K+-ATP酶活性而影响心肌的传导性和自律性[3-4]，DCP对冠心病缓慢性心律失常的治疗作用及其对NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶的影响有待探索。本试验建立冠心病缓慢性心律失常大鼠模型，通过DCP的干预，观察其对NO、cGMP、Na+-K+-ATP酶活性的影响，从NO-cGMP通路及Na+-K+-ATP酶关系角度讨论其发挥作用的可能机制并提供科学资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级Wistar大鼠70只，雌雄各半，体重175 g～210 g，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK (京)2013-0004。

1.1.2 主要试剂和仪器 阿托品注射液(批号:080321)，杭州民升制药公司产品；盐酸小檗碱(批号:040362)，北京化学试剂有限公司产品；水合氯醛(批号：20110612)，北京化学试剂公司产品；NO试剂盒(批号:200020112)，国药集团化学试剂有限公司产品；cGMP试剂盒(批号:120632)，南京建成生物科技公司产品；Na+-K+-ATP酶试剂盒(批号:Z100304)，美国Sigma公司产品。

电子天平(AE160型)，瑞士Mettler公司产品；高速低温离心机(PK121R型)，ALC 公司产品；心电图仪(M3046A型)，Philip公司产品；生物机能实验系统(BL-420 E+型)，成都泰盟公司产品；生物信号采集系统，上海欣曼公司产品；倒置相差显微镜(CKX31型)，Japan Olympus产品；三维微操纵器，Japan Narishige公司产品；拉制仪(P-97型)，USA Sutter公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物造模和分组处理 将清洁级Wistar大鼠70只，分为对照组、模型组、铁皮石斛多糖低剂量组、中剂量组、高剂量组、阿托品组、小檗碱组7组，每组10只，雌雄各半，单笼饲养。参考张明雪-曹洪欣法[5]建立冠心病心阳虚证缓慢性心律失常大鼠模型。对照组基础饲料喂食，自由饮用自来水，模型制备组制作冠心病缓慢性心律失常模型：①喂食高脂饲料6周(高脂饲料配方: 20 g/kg胆固醇,100 g/kg猪油,1.2 g/kg甲基硫氧嘧啶,余为基础饲料)；②各大鼠每日2 h 冷藏于- 2 ℃～ - 4 ℃冰柜中,持续6周。③在35 d～42 d模型制备组大鼠皮下多点注射垂体后叶素(10 μg/kg),正常对照组给予等体积的生理盐水。

①对照组：1 d～42 d喂基础饲料，42 d心电图仪检测心率，43 d取血和心肌做标本。

②模型组：1 d～42 d高脂饮食、寒冷环境，35 d～42 d皮下注射(ih)垂体后叶素(10 μg/kg),每天1次， 余同①组。

③DCP低剂量组(简称低剂量组)：在②组基础上，DCP以双蒸水超声溶解配制， 35 d～42 d(100 mg/kg)灌胃给药(ig),每天1次。

④中剂量组：35 d～42 d(200 mg/kg)ig,余同③组。

⑤高剂量组：35 d～42 d(400 mg/kg)ig,余同③组。

⑥阳性药物对照组(简称阿托品组)： 35 d～42 d静脉注射给药(iv)阿托品(5 mg/kg)，余同③组。

⑦阴性药物对照组(简称小檗碱组)：盐酸小檗碱溶于生理盐水，35 d～42 d 静脉注射盐酸小檗碱(8 mg/kg)，余同③组。

1.2.2 铁皮石斛多糖的制备 铁皮石斛由广西浙商投资有限公司惠赠，经右江民族医学院药理教研室鉴定为兰科石斛属铁皮石斛全草。称取干燥铁皮石斛适量，投入中药粉碎机粉碎后，按1∶10加水煎煮2次，第1次煎煮1 h，第2次煎煮30 min，合并2次滤液，室温离心(3 000 r/min，8 min)，取出上清液，浓缩后真空干燥，经蒽酮-硫酸比色法检测，DCP含量为20.4%。

1.2.3 心室乳头肌的分离 大鼠击颅致昏后，分离、冲洗心脏，置于100% O2饱和、温度36℃±0.5℃台氏液(mmol/L)(NaCl 147，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.05，HEPES 10，glucose 11，NaOH调节至pH7.4)中分离心室乳头肌，固定于恒温浴槽中，并持续流速3 mL/min灌流, 稳定2 h 后进行试验。

1.2.4 电位导引记录 玻璃微电极(电极液3 mol/L KCl ，直流电阻20 MΩ～30 MΩ) 插入 Ag-AgCl 引导电极,用三维微操纵器固定, 以参比电极接地。电极入水后调零,缓慢插入电极至出现静息电位(RP)时, 用电子刺激器发放刺激脉冲( 2 ms, 1.5倍阈电压) , 通过隔离器脉冲刺激豚鼠乳头肌, 诱发乳头肌的动作电位。电信号通过微电极放大器，用生物机能实验系统在计算机上进行实时采集并分析存储数据。有效不应期(ERP)测定采用“8个方波刺激+1个额外刺激”模式，通过改变与前面正常刺激的间隔，测定额外刺激引起动作电位(AP)与前面AP间的最长时间间隔，重复测定6次，取平均值。

1.2.5 指标观察 心率(HR)；动作电位时程(APD)；动作电位0相幅值(APA)；动作电位50%复极化时程(APD50)；90%复极化时程(APD90)；有效不应期(ERP)。

1.2.6 NO、 cGMP、Na+-K+-ATP酶活性检测 100 g/L水合氯醛按350 mg/kg腹腔麻醉，取股动脉血，室温静置6 h，离心(4℃,3 000 r/min，10 min)，取血清，NO检测采用硝酸还原法， cGMP检测采用酶联免疫法，Na+-K+-ATP酶活性检测采用无机磷含量法。按照试剂盒说明书步骤进行。

2 结果

2.1 各组大鼠造模或给药前后心率比较

与对照组比较，模型组造模后、小檗碱组给药后心率均显著降低(P<0.01)；与同组造模前比较，心率也均显著降低(P<0.01)。与模型组造模后比较，高剂量组给药后、阿托品组给药后心率显著增高(P<0.01)(表1)。

2.2 各组大鼠心室乳头肌细胞电位比较

与对照组比较，模型组、小檗碱组APD、APD90、ERP均延长(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，中剂量组APD缩短(P<0.05)；高剂量组、阿托品组APD、APD90、ERP均缩短(P<0.05或P<0.01)(表2 )。

表1 各组大鼠心率比较

Table 1 Comparison of HR in rats of each group

组别Groups剂量/(mg·kg-1)Dose造模前HR/(次·min-1)HRbeforemodeling造模(给药)后HR/(次·min-1)HRaftermodeling对照组Control-408.16±21.11396.88±25.44模型组Model-412.18±18.65292.16±30.12△#低剂量Low100396.48±22.15301.22±32.04中剂量Medium200413.24±20.11318.44±30.25高剂量High400405.33±22.56378.42±27.35*阿托品Atropine5395.62±23.88401.52±21.25*小檗碱Berberine8389.74±25.66284.38±28.64△,#

注：与对照组比较，△P<0.01；与模型组造模后比较，*P<0.01；与同组造模前比较，#P<0.01。

Note: vs control group, △P<0.01；vs model group(after modeling),*P<0.01；vs the same group(before modeling),#P<0.01.

2.3 各组血清NO、 cGMP含量、Na+-K+-ATP酶活性比较

与对照组比较，模型组、小檗碱组血清NO、 cGMP含量均显著升高(P<0.01)；Na+-K+-ATP酶活性显著降低(P<0.01)。与模型组比较，中剂量组NO降低(P<0.05)；高剂量组、阿托品组NO、 cGMP含量均降低(P<0.05或P<0.01)；高剂量组、阿托品组Na+-K+-ATP 酶活性升高(P<0.05或P<0.01)(表3 )。

3 讨论

冠心病缓慢性心律失常主要是指窦性心率低于60次/min的心电泵(窦房结)功能不全的一类症候群,主要表现为病态窦房结综合征(sick sinus syndrome,SSS)。大多数为冠心病引起窦房结和传导组织病变，缺血使其发生退行性变，进而使窦房结和传导组织的起搏或传导功能渐进性衰减所致，临床表现和中医心阳虚证相似，本试验参考相关文献[5]，建立病证结合的冠心病心阳虚证大鼠模型，以具有滋阴生津、通经复脉[6]的铁皮石斛为干预药物，探讨其效应机制。

表2 各组大鼠心室乳头肌细胞电位比较

Table 2 Comparison of AP of myocardial cells in rats of each group

组别Groups剂量/(mg·kg-1)DoseAPD/msAPD50/msAPD90/msAPA/mVERP/ms对照组Control-316.11±18.42188.41±14.11224.43±16.11118.88±10.32251.23±42.41模型组Model-486.04±30.45△△264.22±24.45318.56±27.68△178.66±17.22328.22±70.55△低剂量Low100468.11±31.22250.12±26.33298.66±28.22171.55±19.33312.56±72.68中剂量Medium200287.35±31.25**238.98±28.36261.11±32.12165.32±21.01302.25±66.32高剂量High400296.12±28.45**198.66±17.24248.51±25.33*141.23±13.12256.28±56.11*阿托品Atropine5287.18±26.36**182.22±18.66256.66±26.53*139.45±13.04262.14±61.52小檗碱Berberine8492.15±37.02△△274.86±25.89331.12±28.63△188.06±19.66342.45±73.22△△

注：与对照组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note: vs control group,△P<0.05，△△P<0.01；vs model group,*P<0.05，**P<0.01.

表3 各组血清NO、 cGMP含量、Na+-K+-ATP 酶活性比较

Table 3 Comparison of contents of serum NO, cGMP and activity of Na+-K+-ATP in each group

组别Groups剂量/(mg·kg-1)DoseNO/(mL·kg-1)cGMP/(μmol·L-1)Na+-K+-ATP酶活性/(pmol·L-1)ActivityofNa+-K+-ATP对照组Control-38.78±6.357.82±1.080.426±0.15模型组Model-52.24±15.21△△13.88±2.54△△0.203±0.09△△低剂量Low10049.32±14.8811.98±2.630.218±0.11中剂量Medium20044.88±14.36**11.02±2.330.288±0.14高剂量High40042.62±12.45**8.86±2.15*0.371±0.15*阿托品Atropine543.56±12.85**9.05±2.36*0.412±0.17**小檗碱Berberine858.63±18.35△△16.02±3.51△△0.194±0.12△△

注：与对照组比较，△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。

Note: vs control group,△△P<0.01；vs model group,*P<0.05，**P<0.01.

在试验中采用阿托品和小檗碱分别作为阳性对照药物和阴性对照药物，考虑到阿托品具有加快窦性频率作用，常用于SSS的鉴别。小檗碱别名黄连素，是黄连的主要成分，对心肌电生理有影响[7]，黄连苦寒伤阳，能较为直观地反证铁皮石斛的干预效果。

NO在心血管系统的功能调节中发挥重要作用，作为第二信使，可激活鸟苷酸环化酶(GC),使胞内cGMP含量增加[8]， cGMP含量增加对心脏直接起抑制作用，表现为负性频率、负性肌力、负性传导作用[9-11]，在本试验中观察到，与对照组比较，模型组、小檗碱组血清NO、 cGMP含量均显著升高(P<0.01)，心率均显著降低(P<0.01)，经过DCP干预后，与模型组比较，中剂量组NO降低，而高剂量组及阿托品组NO、 cGMP含量均降低(P<0.05或P<0.01)，心率显著增高(P<0.01)，提示DCP可能是通过NO介导的细胞信号转导通路，使cGMP 浓度降低从而达到提高心率的作用，推测这一作用与剂量的高低有关，且以高剂量起效较明显。

Na+-K+-ATP酶活性与心肌细胞自律性有关， Na+-K+-ATP 酶活性正常是心肌细胞膜内外离子不均匀分布从而形成静息电位的基础，其活性降低有可能导致复极化时程延长，NO 对Na+-K+-ATP酶活性有调节作用[12],在本试验中观察到，与对照组比较，模型组Na+-K+-ATP酶活性显著降低(P<0.01)，给予DCP后，与模型组比较，高剂量组Na+-K+-ATP酶活性升高(P<0.05)，提示NO含量升高可能抑制Na+-K+-ATP酶活性，DCP可能通过调节NO含量、影响Na+-K+-ATP酶活性而间接发挥效应。根据本试验心肌细胞的电位变化，与对照组比较，模型组APD、APD90、ERP均延长(P<0.05或P<0.01)，至少说明与Na+-K+-ATP酶活性降低有关；与模型组比较，高剂量组APD、APD90、ERP均缩短(P<0.05或P<0.01)，提示DCP也有可能通过直接提高Na+-K+-ATP酶活性而发挥作用。

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Effects ofDendrobiumcandidumPolysaccharides on NO,cGMP and Activity of Na+-K+-ATP Enzymes in Rats with Chronic Cardiac Arrhythmias of Coronary Heart Disease

TANG Han-qing, WANG Bing,LIAN Chun-rong, WANG Lu-yao ,HUANG Jun-jie,ZHAO Shan-min,MO Xiao-qiang,WANG Jin-hua

(YoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise,Guangxi,533000,China)

To observe the effects ofDendrobiumcandidumpolysaccharides (DCP) on NO- GC- cGMP channel in rats with chronic cardiac arrhythmias of coronary heart disease and discuss its mechanisms,70 clean grade Wistar rats were randomly divided into control group,model group,DCP low-dose group,medium-dose group,high-dose group,atropine group and berberine group 7 groups with 10 in each group.The rats in model group given were with high fatty diet and cold circumstance for 6 weeks while control group with ordinary diet and circumstance.From the 35th day to the 42nd day,the rats in model group was given were ih with pitutrin (10 μg/kg) while control group with equal normal saline.Based on model group,from the 35th day to the 42nd day, the rats in low-dose group,medium-dose group, high-dose group, atropine group and berberine group given were respectively ig with DCP(100 mg/kg,200 mg/kg,400 mg/kg),iv with atropine (5 mg/kg)and or iv with berberine(8 mg/kg),once a day.On the 43rd day to the contents of serum NO,cGMP and activity of Na+-K+-ATP enzymes,AP of myocardial cells were examined.The results showed that compared with control group, the rats in model group and berberine group,contents of serum NO and cGMP increased significantly (P<0.01),activity of Na+-K+-ATP enzymes reduced significantly (P<0.01).APD,APD90,ERP all increased (P<0.05 orP<0.01),heart rate reduced significantly (P<0.01).Compared with model group,the rats in high-dose group and atropine group,contents of serum NO and cGMP reduced (P<0.05 orP<0.01),activity of Na+-K+-ATP enzymes increased (P<0.05 orP<0.01),APD,APD90,ERP all reduced (P<0.05 or P<0.01),heart rate increased significantly (P<0.01).It was supposed that DCP took an effect on content of serum NO,cGMP and activity of Na+-K+-ATP enzymes to increase heart rate by NO- GC- cGMP channel,which is relevant to its dose.On the other hand,perhaps to take effects by regulating activity of Na+-K+-ATP enzymes via content of serum NO or directly by regulating activity of Na+-K+-ATP enzymes .

Dendrobiumcandidumpolysaccharides (DCP); coronary heart disease; chronic cardiac arrhythmias

2016-04-05

广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻1347003-4)

唐汉庆(1976-)，男，广西合浦人，副教授，博士，主要从事民族医药与中西医结合基础研究。

S853.74

A

1007-5038(2016)12-0077-05