郭 璐，张 晶,沙芳芳,赵兴然,王 敬,王向红，2*

(1.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071001;2.河北省农产品加工工程技术研究中心，河北保定 071001)

倍他米松ELISA检测方法的建立

郭 璐1，张 晶1,沙芳芳1,赵兴然1,王 敬1,王向红1，2*

(1.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071001;2.河北省农产品加工工程技术研究中心，河北保定 071001)

为建立倍他米松(BET)ELISA检测方法，先使BET与琥珀酸酐反应，再采用活化酯法与牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原；其次，利用免疫动物获得多克隆抗体，经Sephrose 4B-proteinA方法对抗体进行纯化；最后，建立倍他米松ELISA检测方法。结果表明，免疫抗原偶联成功，获得了亲和力较高的多克隆抗血清，间接竞争ELISA测定其滴度为102 400、IC15为6.60×10-5ng/mL和IC50为0.97 ng/mL。该方法适用于残留在动物性食品中的BET现场大批量检测。

倍他米松；人工抗原；多克隆抗体；酶联免疫吸附试验

倍他米松(Betamethasone,BET)为肾上腺皮质激素类药物[1]，具有较强的抗炎、抗过敏、抗休克及控制皮肤过敏作用[2]，对垂体、肾上腺皮质的抑制作用较强。BET在家畜临床中有较广泛的应用，但人体通过动物性食品摄入过量BET可致代谢紊乱、骨质疏松等，尤其可能会对儿童的正常生长造成较严重的影响。在此背景下，建立健全BET快速检测方法有很强的现实意义。

BET的含量检测方法有UV、GC、GC/MS、HPLC[3]、LC/MS[4]等。UV是最具便捷性的，但准确度欠缺、特异性不好，通常局限在医院制剂的一般测定上使用。GC、GC/MS检测手段必须通过硅烷化试剂处理，因此操作复杂。HPLC[5-6]检测方法是现如今使用较多，用于BET制剂含量水平的测定手段，但是很少在文献中看到使用。LC/MS检测方法虽然灵敏度较高，专属性较强，但该方法所需仪器价格高昂。基于以上事实，根据免疫学快速检测方法的原理，本试验拟采取特异性多克隆抗体技术来制作检测下限低、特异性高的抗体，构建出与之相对应的ELISA检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 BET、牛血清白蛋白(BSA)、福氏完全佐剂(FCA)、福氏不完全佐剂(FICA)、卵清白蛋白(OVA)、琥珀酸酐、无水吡啶、N，N双环乙烷碳二亚胺(DCC)、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、过氧化氢脲、十二烷基硫酸钠(SDS)、N-羟丁二酰亚胺(NHS)，美国Sigma公司产品；蛋白A琼脂糖凝胶(CL-4B)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，北京热景生物技术有限公司产品；其他试剂为分析纯。

1.1.2 仪器 紫外分光光度仪，上海尤柯仪器股份有限公司产品；冷冻离心机，上海安乐仪器厂产品；酶标仪、洗板机，Thermo公司产品；电子分析天平，北京贝多利斯仪器公司产品；96孔酶标板，Costar产品；垂直电泳仪，北京六一仪器厂产品；单道、冷冻干燥机，北京博泰康仪器公司产品；八道微量可调移液枪，上海大龙医疗设备有限公司产品；超滤离心管，美国Millipore公司产品。

1.1.3 试验用动物 2只健康雄性日本大耳白家兔,8 周龄，体重约1.5 kg，购自保定养兔基地。购买后观察7 d，以确认其身体有无影响试验结果的异常状况。1.1.4 缓冲溶液系统 覆盖缓冲液:0.2 mol/L pH9.6的NaHCO3溶液；洗涤液:0.01 mol/L PBST；TMB底物溶液；终止液:1.2 mol/L 硫酸溶液；稀释缓冲液:0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液；洗脱缓冲液: 0.1 mol/L pH 2.7甘氨酸盐酸缓冲液；稀释缓冲液: 0.01 mol/L pH 7.4 PBS溶液；中和缓冲液: 1 mol/L pH 9.0Tris-HCl缓冲液；稀释缓冲液: 0.01 mol/L pH7.4 PBS溶液。

1.2 方法

1.2.1 混合酸酐法制备BET半抗原 取40 mg BET加5 mL无水吡啶至20 mL反应瓶内，充分溶解。然后加入50.996 mg重结晶琥珀酸酐，加热回流(反应所需时间通过TLC监测确定)。将反应获得混合物移至含冰蒸馏水45 mL、浓盐酸6 mL的混合液中，过滤分离析出的沉淀物。蒸馏水清洗使沉淀物的pH为5.0，干燥保存记作半抗原。

1.2.2 活泼酯法合成BET完全抗原 合成步骤参考Matsuura S等[7]方法并稍加改进，取5 mg半抗原、7.331 mg NHS、13.430 mg DCC溶解在200 μL的DMF中，并振荡至无沉淀，常温条件下孵育3 h。然后吸取120 μL反应液逐滴加至10 mg BSA(溶于2 mL 0.1 mol/L NaHCO3)当中，低温条件下反应2 h，4 ℃条件下过夜；此外，把80 μL的反应液逐滴加至10 mg OVA(溶解在2 mL 0.1 mol/L NaHCO3)当中，此后步骤同上，最后，进行高速离心并使用超滤管将杂质从溶液中分离出来。所得上清液保存于-20 ℃环境中。

1.2.3 SDS-PAGE法鉴定偶联物的合成 制备试验所需的分离胶，丙烯酰胺含量为0.1 g/mL，浓缩胶含量为0.05 g/mL。将均为10 mg/mL的BSA、BET-BSA、OVA、BET-OVA加入到等体积的上样缓冲液当中，并混合均匀，高温处理5 min后加样。将初始电压调至为80 V，当浓缩胶跑完之后，立即增加电压至120 V，当指示剂跑出分离胶之后，随即终止通电。在常温下，使用考马斯亮蓝进行染色过夜，制备250 mL/L乙醇与80 mL/L乙酸混合的脱色液，在水平摇床上进行洗涤，直至胶体透明，最后使用凝胶成像仪进行结果的观察和记录。

1.2.4 BET多克隆抗体的制备 将人工免疫原BET-BSA溶解在0.001 g/mL的盐水当中，同等剂量的佐剂混合，乳化充分，然后免疫2只健康雄性日本大耳白家兔(8 周龄)，免疫方式是在其后颈部位6点、大腿部位2点进行皮下注射，连续接种6次，每次间隔14 d，免疫程序见表1。第3、4、5次加强免疫程序结束后10 d，在家兔耳静脉取血，通过ELISA检测手段对滴度进行分析，同时着重观察其特异性程度。在第6次强化免疫过程之后7 d，取其心房内的鲜血，并将其放置于37 ℃环境下1 h，之后在4 ℃进行充分凝血，过夜，将血清进行4 000 r/min离心15 min，加入叠氮钠(0.000 1 g/mL)放置于-20 ℃保存。

表1 免疫程序

Table 1 The procedure of immunization

免疫次数Timesofimmunization免疫剂量/只Immunedoseperrabbit时间间隔/dTimeinterval首次免疫1stimmunization1mg免疫原+1mL生理盐水+1mLFCA1mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFCA-第2次加强免疫2ndboosterimmunization0.5mg免疫原+1mL生理盐水+1mLFICA0.5mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14第3次加强免疫3rdboosterimmunization0.5mg免疫原+1mL生理盐水+1mLFICA0.5mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14第4次加强免疫4thboosterimmunization0.5mg免疫原+1mL生理盐水+1mLFICA0.5mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14第5次加强免疫5thboosterimmunization0.5mg免疫原+1mL生理盐水+1mLFICA0.5mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14第6次加强免疫6thboosterimmunization1mg免疫原+1mL生理盐水+1mLFICA1mgimmunogen+1mLnormalsaline+1mLFICA14

1.2.5 Bet多克隆抗体的鉴定

1.2.5.1 效价测定 采用间接ELISA分析法测定多克隆抗体血清的效价，具体操作如下：抗原(BET-OVA)4 ℃包被过夜。洗板，加0.05 g/mL脱脂奶粉，200 μL/皿，37 ℃条件下孵育1 h封闭。洗板，加使用PBS(1×)倍比稀释成试验所需的不同浓度的血清，100 μL/皿，37 ℃条件下孵1 h，洗板。加用PBS(1×)1∶2 500倍稀释的辣根过氧化酶标羊抗兔血清，100 μL/皿，37 ℃条件下孵育0.5 h，加底物液37 ℃孵育30 min终止反应。450 nm波长下测定OD值。

1.2.5.2 亲和力测定 采用间接ELISA分析方法测定多克隆抗体血清亲和力，具体操作如下：抗原(BET-OVA)4℃包被过夜。洗板，加0.05 g/mL脱脂奶粉，200 μL/皿，37 ℃条件下孵育1 h封闭。洗板，加使用PBS(1×)倍比稀释成试验所需的不同浓度的BET标准品，100 μL/皿，37 ℃条件下孵育1 h，洗板。加用PBS(1×)1∶2 500倍稀释的辣根过氧化酶标羊抗兔，100 μL/皿，37 ℃条件下孵育0.5 h，加底物液37 ℃孵育30 min终止反应。450 nm波长下测定吸光值。

由所测得到的吸光度值计算其抑制率(inhibition)，计算公式如下：

抑制率(I)%=[1-(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白)]×100

以x轴表示标品不同浓度，y轴为其相应浓度下计算所得抑制率，绘制出抑制曲线。

1.2.6 抗体浓度测定 使用ProteinA-Sepharose-4B亲和层析柱将上述试验所得抗血清进行纯化，收集其OD值大于0.2的试管溶液，合并后分别在280 nm和260 nm波长处对4 ℃抗体进行扫描，把所得OD值代入公式：抗体含量(mg/mL)=(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数。

1.2.7 抗体纯化效果的鉴定 使用了紫外分光光度计法[8]对其纯度进行检测，首先进行PBS缓冲液的检测，其结果作为基线，在280 nm波长处对用PBS适当稀释后的未纯化的血清和纯化后的血清分别进行紫外光谱扫描[9]。

采用间接竞争法检测血清纯度，并对处理前后的结果进行分析，使用未经处理以及处理后的抗体进行间接ELISA竞争反应，制作出抑制曲线，并分析试验对抗体灵敏度的影响。

1.2.8 ELISA分析方法的建立 根据间接竞争ELISA的检测方法，检测到不同浓度梯度BET的OD值，通过吸光值数值来计算出对应的抑制率，并绘制成标准曲线。

2 结果

2.1 BET-BSA完全抗原的鉴定

在SDS-PAGE电泳系统中蛋白质分子质量大小是迁移率的主要影响因素，由此可认为样品分子质量大小与迁移率成反比。从图1中两个条带可以看出，载体蛋白BSA条带比BET-BSA条带略微优先，据此可推断人工抗原的分子量大于载体蛋白，人工抗原合成成功。

2.2 抗体效价的测定

在进行动物免疫试验中，在一段时期内，所进行的免疫反应试验次数同血清中抗体效价成正比，BET-1从第1次取血抗血清效价为3 200到最后一次心脏取血后抗血清效价均达到102 400，BET-2从第1次取血抗血清效价为6 400到最后一次心脏取血后抗血清效价均达到102 400。由此说明，此免疫程序能获得较高效价的抗体。

1.BSA; 2.BET-BSA

2.3 抗血清亲和力的测定

由4次取血后测定的间接竞争曲线图2和图3能够看出，同一浓度BET的抑制率大体上同免疫次数成正比，同时，BET-1的IC50从8.20 ng/mL下降到1.72 ng/mL，对于BET-2的IC50从15.05 ng/mL下降到0.37 ng/mL。因此推断，抗血清对BET的亲和力可通过本免疫试验得到显著增强。

图2 BET-1抗血清亲和力变化

图3 BET-2抗血清亲和力变化

2.4 抗体纯化

在280 nm和260 nm波长处[10]对4 ℃抗体进行扫描后，把所得OD值代入公式：抗体含量(mg/mL)=(1.45×OD280-0.74×OD260)×稀释倍数。计算得出纯化后BET-1抗体的浓度是1.06 mg/mL，BET-2的浓度是1.53 mg/mL(图4)。

图4 抗血清纯化前后色谱图

据图5和图6可看出，未经纯化的血清光谱扫描图中在415、537、578 nm处均有较为明显杂质峰出现，经纯化后的血清未出现杂质峰，并且在280 nm有比较明显的蛋白吸收峰，据此可以表明抗血清在纯化以后可得比较单一的免疫球蛋白。

1.未经纯化抗血清；2.纯化后抗血清1.Unpurified antiserum; 2.Purified antiserum

图7和图8间接竞争ELISA鉴定抗血清纯化效果可以推断，经纯化后的抗血清与抗原的亲和力有所提高，IC50和IC15有所下降，表明纯化多克隆抗体可在一定程度上增强抗原抗体特异性反应。

2.5 ELISA分析方法的建立

通过对两种抗体BET-1和BET-2的效价和亲和力测定，确定了BET-2抗体作为本研究的检测抗体。本次试验利用矩阵法优化包被原的最适浓度和抗血清的稀释度，初步所选最佳工作浓度是吸光度在1.0左右的包被量和抗血清稀释度。进行间接竞争ELISA反应，建立BET的标准曲线，x轴以BET的浓度，y轴抑制率(图9)。 对图9中的曲线进行直线方程拟合，得到线性回归方程为y=3.647 41ln(x)+50.11(R2=0.987 7)，经计算可得IC50=0.97 ng/mL，最低检出限IC15=6.60×10-5ng/mL，说明了免疫抗血清中含有较高纯度抗BET抗体。

1.未经纯化抗血清；2.纯化后抗血清1.Unpurified antiserum;2.Purified antiserum

图7 BET-1抗血清纯化前后其亲和力的变化图

图8 BET-2抗血清纯化前后其亲和力的变化图

3 讨论

本试验采取混合酸酐法成功合成免疫原(BET-BSA)和包被原(BET-OVA)，并经用SDS凝胶电泳法对试验的作用进行了分析，使得试验结果更具理论指导性。此外，分期注射的免疫方法能够获较得高效价及结合能力更高的抗体。多克隆抗体通过进一步纯化后，利用紫外分光光度计对血清纯度进行了测定，同时还使用了间接竞争ELISA法加以佐证，通过减少对抗原抗体特异性有影响的其他蛋白，能够显著增强该抗体的检测灵敏度，其IC15降低。所以，特异性高、结合能力好的抗体制备成功，给ELISA方法的进一步发展提供了重要的实际依据，同时也推动了其向着快速检测方向的发展。建立了间接竞争ELISA方法，并绘制其标准曲线，得到该方法的IC50为0.97 ng/mL，最低检出限可达6.60×10-5ng/mL，此方法检测不仅仅下限低、抗干扰能力强，同时也兼具ELISA检测法微量、快速、低成本以及操作简单等优势。

图9 BET标准曲线

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Establishment of ELISA Method for Detecting Betamethasone

GUO Lu1,ZHANG Jing1,SHA Fang-fang1,ZHAO Xing-ran1,WANG Jing1,WANG Xiang-hong1，2

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding,Hebei，071001,China;2.HebeiCenterforAgriculturalProductsProcessingEngineeringandTechnologyResearch,Baoding,Hebei，071001,China)

To establish betamethasone (BET) ELISA analysis method, the first step is to have BET reacted with amber acid anhydride and then coupled with bovine serum albumin (BSA) to produce immunogen with the help of active ester method; second, polyclonal antibody is obtained by immunizing rabbits, and the antibody is purified via Sephrose 4B-proteinA method; the final step is to construct BET ELISA analysis method. The results showed that immunogen succeeded in the coupling,and polyclonal antisera with high affinity were obtained. The detection by indirect competition ELISA showed its titer is 102 400, IC156.60×10-5ng/mL, and IC500.97 ng/mL. This method is applicable in mass field detection of BET residue in the animal derived food.

betamethasone;artificial antigen;polyclonal antibody；ELISA

2016-03-10

河北省科技计划项目(152776120D)

郭 璐(1990-)，女，河北定州人，硕士研究生，主要从事农产品加工与贮藏工程研究。*通讯作者

S859.83

A

1007-5038(2016)12-0050-05