谢志勤，谢芝勋，范 晴，邓显文，谢丽基，罗思思，黄 莉，黄娇玲，张艳芳，王 盛，张民秀，奉 彬，刘加波，庞耀珊

(广西壮族自治区兽医研究所，广西动物疫病病原生物学与诊断重点实验室，广西南宁 530001)

H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法的建立

谢志勤，谢芝勋*，范 晴，邓显文，谢丽基，罗思思，黄 莉，黄娇玲，张艳芳，王 盛，张民秀，奉 彬，刘加波，庞耀珊

(广西壮族自治区兽医研究所，广西动物疫病病原生物学与诊断重点实验室，广西南宁 530001)

根据GenBank中H9亚型禽流感病毒HA基因和禽肺病毒F基因的保守序列，通过Blast进行比对，在各自保守的基因序列中分别设计了两对特异性扩增引物，引物扩增的片段大小分别为569 bp和424 bp，应用这两对引物建立了H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒的二重RT-PCR检测方法，对建立的方法进行了特异性试验、敏感性试验和临床样品验证。对检测为阳性的样品进行克隆和序列分析，以验证本方法的准确性。特异性试验结果表明，所有参试的H9亚型禽流感病毒都能扩增出大小为569 bp的片段，参试的禽肺病毒毒株扩增出424 bp的片段，没有其他条带出现，而对照的参试毒株在569 bp和424 bp处没有任何条带；敏感性试验结果表明，本试验建立的方法能检测到10 pg的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒RNA模板。应用本试验建立的方法对广西采集的病鸡样品132份进行检测，H9亚型禽流感病毒阳性的样品有6份，禽肺病毒阳性的样品2份；随机各挑取2份H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒阳性PCR产物进行克隆和序列分析，经比对分析，2份H9亚型禽流感病毒阳性PCR产物与H9亚型禽流感病毒(No.JF715045.1)100%同源，2份禽肺病毒阳性PCR产物与禽肺病毒株(No.AF187154) 100%同源。本试验建立的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点，可以用于临床快速准确检测H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒。

H9亚型禽流感病毒；禽肺病毒；二重反转录-聚合酶链反应；检测

H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus H9 subtype，AIV H9)和禽肺病毒(Avian pneumovirus，APV)是危害养鸡业的两种重要病毒，H9亚型禽流感病毒属正黏病毒科A型流感病毒属,病毒基因组为分节段的单股负链RNA ,包含HA、NA、M、PB1、PB2、NP、PA、NS 8个基因组[1]。禽肺病毒属于肺病毒亚科中的成员[2]，全基因组长约14 kb，为负链RNA。基因中有8种编码蛋白，依次为核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、第二基质蛋白(M2)、小疏水蛋白(SH)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白L[3-4]。在8种蛋白中，F蛋白是很重要的结构蛋白，参与吸附细胞的作用[5]。目前将禽肺病毒划分为4个亚型，分别命名为A、B、C、D亚型，A亚型和B亚型在世界各国都有发生，C亚型只在美国发生，D亚型则在法国出现[4,6-7]。

在临床上这两种病毒引起的症状很相似，都可以引起禽上呼吸道的症状。禽肺病毒除了引起禽出现喷嚏、眼结膜潮红和泪腺肿胀外，其明显的特征是后期出现头部皮下肿大，有些伴随有神经症状[8]。感染产蛋鸡可以引起产蛋下降 2%～40%。感染种鸡后种蛋的孵化率和出壳率都降低[9]。H9亚型禽流感病毒感染鸡同样也会引起上呼吸道的症状，主要以咳嗽、呼吸啰音和支气管堵塞为特征。蛋鸡感染可以引起产蛋下降，在感染期间继发其他疫病时可引起鸡大批死亡[10]。在临诊上很难将它们区别，需通过实验室进行确诊。目前实验室诊断这两种传染病的方法主要有病毒分离[11-12]、RT-PCR[13,16]、ELISA[17-18]、LAMP[19]和免疫电化学检测方法[20]等。

H9亚型禽流感病毒HA蛋白和禽肺病毒融合蛋白(F)是很重要的病毒结构蛋白，在各自病毒中各具特征性，常常用于检测并鉴别这两种病毒。目前，还未见应用二重RT-PCR方法一次扩增同时将这两种病毒区别的报道。本研究通过在各自基因保守区域设计两对不同的引物，建立二重RT-PCR一次扩增鉴别H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒的方法，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用毒株 H9亚型禽流感病毒株：H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)、H9N2(A/Duck/Guangxi/RX/2009)、H9N2(A/Chicken/Guangxi/067C4/2010)、H9N2(A/Chicken/Guangxi/066C10/2010)由本室保存；禽肺病毒(APV/MN-10)由美国滨夕法尼亚大学Lu教授惠赠；对照毒株鸡传染性支气管炎病毒(Mass 41)、鸡传染性喉气管炎病毒(北京株，ILTV )、禽脑脊髓炎病毒(AEV Van)、鸡毒支原体(MG S6)均由本实验室保存；鸡新城疫病毒 (NDV La Sota株)、禽呼肠病毒(Reo S1133)和禽大肠埃希菌(E.coliO2)购自中国兽医药品监察所；鸡马立克病(MDV)疫苗毒购自南京梅里亚动物保健品公司。

1.1.2 试验用SPF鸡胚 从北京梅里亚种禽有限公司购进SPF种蛋，经本室自动化孵化箱37℃孵化至7到10日龄。

1.1.3 仪器和试剂 T100 PCR扩增仪为美国Bio-rad产品；反转录酶AMV、RNA抑制剂、dNTPs、自由引物、2×PremixTaqTM mix 等购自大连宝生生物工程有限公司；小量质粒提取试剂盒，胶回收纯化试剂盒购自美国OMEGA公司；其他试剂为进口或国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根据基因库中已发表的H9亚型禽流感病毒HA基因序列(基因库序列号：JF715045.1)和禽肺病毒F基因序列(基因库序列号：AF187154)，通过DNAStar MegAlign软件对下载的序列进行比对分析，找出H9亚型禽流感病毒HA基因序列和禽肺病毒F基因序列各自保守的基因序列区间。应用PrimerSelect 软件在其保守的基因序列区间设计了两对特异性引物，并在线Blast比对分析，经分析符合要求的引物序列发给大连宝生生物有限公司进行合成(表1)。

表1 用于H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒扩增的引物序列

Table 1 Primer sequences used for AIV H9 and APV

引物Primers序列Sequence(G+C)/%大小/bpSize位置SiteAIVH9F5'-ACGCCCAATACACAAATAATCAAG-3'37.5569518-541AIVH9R5'-GAATCCATACCAACCAGCAACTA-3'43.41086-1064APVF5'-ATCGGGCAATGGTCAGAAGG-3'55424753-772APVR5'-ACACCGTCATAACAGGCTACCAA-3'47.81176-1154

1.2.2 病毒的增殖及处理

1.2.2.1 H9亚型禽流感病毒的增殖及处理 将H9亚型禽流感病毒株用灭菌的PBS溶液按1∶100倍进行稀释，经鸡胚尿囊腔分别接种10日龄的SPF鸡胚，每胚0.2 mL，收集24 h～120 h死亡鸡胚和活胚尿囊液，鸡胚尿囊液经8 000 r/min离心5 min，上清液用来提取RNA或保存在-70 ℃备用。

1.2.2.2 禽肺病毒的增殖及处理 按谢志勤报道的方法[21]进行增殖和处理。

1.2.3 临床样品收集及处理 取病鸡的肺、气管、脾、肾等组织适量，按1∶5加入灭菌的PBS溶液进行研磨，研磨后的悬液分装于1.5 mL离心管，放在-70℃冰柜反复冻融3次，8 000 r/min离心5 min，上清液用作病毒增殖或提取病毒RNA。

1.2.4 RNA的提取 按谢志勤报道的方法[22]进行总RNA提取，提取的总RNA置-20℃保存或直接用于反转录。

1.2.5 RT-PCR扩增条件的优化 优化RT-PCR 扩增反应体系所用的 buffer、dNTPs、Mg2+、9碱基自由引物、反转录酶(AMV)、RNA 抑制剂、RNA模板浓度、Taq酶以及扩增反应的退火温度、程序等，优化出最佳各种反应浓度和条件。

1.2.6 扩增产物的检测 用1倍的TBS溶液制备浓度为15 g/L的琼脂糖凝胶，取2 μL加样缓冲液与10 μL扩增产物混合，点入琼脂糖凝胶孔中，同时点入标准分子质量作为对照，以80 V/cm电泳，至样品超过凝胶中线，停止电泳，取下凝胶经Gelred(Biotium产品，1万倍稀释)染色后，在紫外线台上观察并拍照，分析记录结果。

1.2.7 特异性及敏感性试验 以AIV H9N2(066C)和APV/MN-10以及对照的NDV La Sota、IBV Mass 41、ILTV(Beijing)、AEV Van、MG S6、Reo S1133、MDV和E.coliO2的RNA或DNA作为模板，进行RT和PCR扩增，以检测其特异性。测定AIV H9N2(066C)和APV/MN-10的RNA浓度，然后进行10倍梯度稀释，取各稀释度的RNA 1 μL作为模板进行敏感性测定

1.2.8 临床样品的检测 提取保存的经1.2.3处理的132份广西不同地区养鸡场收集的病鸡的肺、气管、脾及肾样品的RNA，应用建立的二重RT-PCR检测方法对提取的样品RNA进行检测。同时取经1.2.3处理的相同样品，经0.2 μm滤膜无菌过滤，进行病毒分离。卵黄囊接种7日龄SPF鸡胚，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚。以评价本方法对临床样品检测的实用性。

1.2.9 序列分析比对验证 随机挑选H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒各2份PCR检测阳性样品进行序列测定比对验证，将回收纯化的PCR检测阳性产物与PMD18-T进行连接，然后转化到大肠埃希菌DH5α中。提取转化的质粒DNA，用双酶切和PCR进行鉴定。经鉴定为阳性的克隆菌，送宝生物工程(大连)有限公司测定序列。应用DNA Star软件对测定的序列与H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒株进行比对分析。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增产物检测

将12μL RT-PCR产物(含2 μL加样缓冲液)加入预先用1倍TBE溶液制备的15 g/mL琼脂糖凝胶孔中，以80 V/cm电压进行凝胶电泳，后经goldenview染色，放紫外线下进行观察拍照，可见H9亚型禽流感病毒株样品扩增出大小约为569 bp的明亮条带，APV毒株样品扩增出约为424 bp的明亮条带，与预期大小相符。

2.2 RT-PCR扩增条件优化的确定

经对RT-PCR扩增各成分配比和反应条件的优

化筛选，获得最佳的配比和反应条件为：反转录(RT)采用10 μL 反应体系：5×RT buffer(含10 μmol/L dNTPs、Mg2+) 2 μL，50 μmol/L Random 9 mer(自由引物) 0.5 μL,反转录酶(AMV) 0.5 μL，RNA 抑制剂 0.5 μL，AIV H9N2(066C10)和APV/MN-10模板RNA各 2 μL，用灭菌的无RNA水补足10 μL。置PCR仪设定反应程序：42 ℃ 60 min，95℃ 5 min。反应结束后进行 PCR 扩增，采用25 μL反应体系：2×PremixTaqTM mix 12.5 μL[宝生物工程(大连)有限公司产品，产品目录号：RR003A，内含10 μmol/L dNTPs、Mg2+、5 unit ExTaq酶]，反转录产物 2 μL，50 pmol/μL 的APV上、下游引物各 0.25 μL，50 pmol/μL 的AIV H9上、下游引物各 0.25 μL，灭菌超纯水补足 25 μL，置PCR仪设定反应程序：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,35个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃结束反应。

2.3 特异性及敏感性试验

参试的H9亚型禽流感病毒株H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)、H9N2(A/Duck/Guangxi/RX/2009)、H9N2(A/Chicken/Guangxi/067C4/2010)、H9N2(A/Chicken/Guangxi/066C10/2010)均扩增出大小约为569 bp的特异性条带，APV扩增出约424 bp的特异性条带，而对照的NDV La Sota、IBV Mass 41、ILTV(Beijing)、AEV Van、MG S6、Reo S1133、MDV和E.coliO2在247 bp与424 bp处均无条带出现(图1)。以10倍梯度稀释的AIV H9N2(066C10)和APV/MN-10的核酸作为模板进行敏感性试验，结果最低能检测到10 pgRNA模板(图2)。

M.DNA 标准DL 1 000；1.APV RNA；2.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA；3.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA和APV RNA的混合模板(模板摩尔比1∶1)；4.AIV H9N2(A/Duck/Guangxi/RX/2009)RNA和APV RNA的混合模板；5.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/067C4/2010)RNA和APV RNA的混合模板；6.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/066C10/2010)RNA和APV RNA的混合模板；7.NDV(La Sota)RNA ；8.IBV Mass 41；9. AE Van；10. Reo S1133；11.ILTV(北京株)；12.MDV(疫苗株)；13.MG S6；14.大肠埃希菌O2

M.DNA Marker DL 1 000; 1.APV RNA; 2.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA; 3.AIV H9N2 (A/Chicken/Guangxi/LF/2007) RNA and APV RNA mixed template (template molar ratio 1∶1); 4.AIV H9N2 (A/Duck/Guangxi/RX/2009) RNA and APV mixed template of RNA; 5.AIV H9N2 (A/Chicken/Guangxi/067C4/2010) RNA and APV mixed template of RNA; 6.AIV H9N2 (A/Chicken/Guangxi/066C10/2010) RNA and APV mixed template of RNA; 7.NDV (La Sota) RNA; 8.IBV Mass 41; 9.AE Van; 10. Reo S1133; 11.ILTV (Beijing strain); 12.MDV (vaccine strain); 13.MG S6; 14.E.coliO2

图1 二重RT-PCR特异性试验结果

Fig.1 Specificity test results of duplex PCR

2.4 临床样品检测结果

对132份病鸡样品核酸进行检测，检测结果有6份样品为鸡H9亚型禽流感病毒阳性，2份样品为禽肺病毒阳性，其余的124份样品均不是H9亚型禽流感病毒或禽肺病毒阳性。经样品病毒分离鉴定，临床样品检测与病毒分离鉴定结果一致(图3)。

2.5 序列分析验证

对随机抽取的2份鸡H9亚型禽流感病毒和2份禽肺病毒阳性PCR扩增产物进行序列测定，利用DNAstar软件进行分析，经比对2份鸡H9亚型禽流感病毒阳性PCR产物与H9亚型禽流感病毒株(No.JF715045.1)100%同源，2份禽肺病毒阳性PCR产物与禽肺病毒株(No.AF187154) 100%同源。

M.DNA 标准DL 1 000；1.100 ng AIV H9和100 ng APV RNA；2.10 ng AIV H9和10 ng APV RNA；3.1 ng AIV H9和1 ng APV RNA；4.100 pg AIV H9和1 000 pg APV RNA；5.10 pg AIV H9和10 pg APV RNA；6.1 pg AIV H9和1 pg APV RNA；7.100 fg AIV H9和100 fg APV RNA

M.DNA Marker DL 1000；1.100 ng AIV H9 and 100 ng APV RNA；2.10 ng AIV H9 and 10 ng APV RNA；3.1 ng AIV H9 and 1 ng APV RNA；4.100 pg AIV H9 and 100 pg APV RNA；5.10 pg AIV H9 and 10 pg APV RNA；6.1 pg AIV H9 and 1 pg APV RNA；7.100 fg AIV H9 and 100 fg APV RNA

图2 二重RT-PCR的敏感性试验结果

Fig.2 Sensitivity test results of duplex PCR

M.DNA 标准DL 1 000 ；1.APV RNA；2.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA；3.APV RNA和AIVH9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA的混合模板(模板摩尔比1∶1)；4.阴性对照(正常鸡肺、气管组织RNA)；5.临床样品C20120427 RNA；6.临床样品C20120314 RNA；7.临床样品C20130201 RNA；8.临床样品C20130417 RNA；9.临床样品C20130618 RNA；10.临床样品C20130707 RNA；11.临床样品C20130821 RNA；12.临床样品C20130911 RNA；13.临床样品C20130928 RNA；14.临床样品C20131012 RNA；15.临床样品C20131016 RNA；16.临床样品C20131018 RNA

M.DNA Marker DL 1000; 1.APV RNA; 2.AIV H9N2(A/Chicken/Guangxi/LF/2007)RNA;3.RNA APV and AIVH9N2 (A/Chicken/Guangxi/LF/2007) RNA mixed template (template molar ratio 1∶1) ;4.Negative control (normal chicken lung, trachea tissue RNA) ;5.Clinical sample RNA C20120427;6.Clinical sample RNA C20120314;7.Clinical sample RNA C20130201;8.Clinical sample RNA C20130417;9.Clinical sample RNA C20130618;10.Clinical sample RNA C20130707 RNA;11.Clinical sample RNA C20130821 RNA;12.Clinical sample RNA C20130911 RNA;13.Clinical sample RNA C20130928 RNA;14.Clinical sample RNA C20131012 RNA;15.Clinical sample RNA C20131016 RNA;16.Clinical sample RNA C20131018 RNA

图3 二重RT-PCR对临床样品检测结果

Fig.3 Clinical sample test results of duplex PCR

3 讨论

防控鸡主要疫病的发生一直是现代养鸡业的首要任务，对鸡危害严重的几种疫病中，禽流感仍然是防控的主要传染病，虽然我国一直对禽流感病毒引起的疾病采取各种预防措施，但是每年却因该病引起的损失仍然十分巨大。相比禽流感等重大疫病而言，禽肺病毒引起鸡的疾病还没有引起人们足够重视和注意。禽肺病毒最早报道是引起火鸡的呼吸道疾病，随后在欧洲流行，病死率可高达25%～40%[23]。我国最早报道该病是1998年[24]， 2009年郭龙宗等[25]进行的血清学调查，发现我国鸡群中禽肺病毒感染很普遍，感染率高的可达100%，其引起的损失难以估计。

禽肺病毒和H9亚型禽流感病毒引起鸡的症状临床上很相似，主要表现为上呼吸道的症状，尤以喷嚏、眼结膜潮红、泪腺肿、产蛋下降、孵化率低以及神经症状为主。单靠临床症状很难将它们区别开来，需要进一步通过实验室进行确诊。虽然检测鉴别H9亚型禽流感病毒的方法有很多，但是临床上还没有同时检测鉴别禽肺病毒和H9亚型禽流感病毒的方法，因此建立一种同时检测鉴别这两种病毒方法具有重要的现实意义。

禽肺病毒的融合蛋白(F)和禽流感病毒的血凝蛋白(HA)已被证实是很重要的结构蛋白，其蛋白序列结构不一样，但都具有种属特征性，因此这两个蛋白往往被用于检测区分各自的病毒特征。本研究利用禽肺病毒的融合蛋白(F)和禽流感病毒的血凝蛋白(HA)种属特征性，在其基因保守序列区域设计了分别扩增禽肺病毒和H9亚型禽流感病毒的两对特异性引物，建立了二重RT-PCR方法一次扩增鉴别禽肺病毒和H9亚型禽流感病毒的方法。特异性试验结果证实，所有参试的H9亚型禽流感病毒毒株均能扩增出大小约为569 bp的特异性条带，APV扩增出约424 bp的特异性条带，而对照的参试毒株NDV La Sota、IBV Mass 41、ILTV(Beijing)、AEV Van、MG S6、Reo S1133、MDV和E.coliO2在569 bp和424 bp处均无条带出现，说明本试验建立的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒检测方法具有特异性。本试验建立的方法最低能检测10 pg的禽肺病毒和H9亚型禽流感病毒的RNA模板，表明本试验建立的方法具有很好的敏感性。

为了进一步验证本试验建立的方法，将建立的方法对临床样品进行检测，结果鸡H9亚型禽流感病毒阳性6份，阳性检测率为4.55%(6/132)，禽肺病毒阳性2份，阳性检测率为1.51%(2/132)，检测的结果与分离鉴定结果一致。同时对2份H9亚型禽流感病毒阳性样品和2份禽肺病毒阳性样品进行序列测定比较，证实所扩增的各自基因序列片段正确，说明本试验建立的方法具有很好的实用性，可以用于临床检测，为快速鉴别检测H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒提供了一种更快捷的方法。

综上所述，本研究建立了二重RT-PCR检测并鉴别H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒的方法，通过对建立方法的特异性、敏感性和临床样品检测，证实所建立的方法特异、敏感。临床样品检测结果经与分离鉴定和序列测定比较，结果均正确。该方法的建立为快速检测并鉴别H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒提供了技术保障。

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Development of a Duplex RT-PCR for Detecting Avian Influenza H9 Subtype and Avian Pneumovirus

XIE Zhi-qin,XIE Zhi-xun,FAN Qing,DENG Xian-wen,XIE Li-ji,LUO Si-si,HUANG Li,HUANG Jiao-ling,ZHANG Yan-fang,WANG Sheng,ZHANG Min-xiu,FENG Bin,LIU Jia-bo,PANG Yao-shan

(GuangxiVeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofAnimalEpidemicEtiologyandDiagnosis,Nanning,Guangxi,530001,China)

A rapid and specific method for detection of avian influenza virus H9 subtype (AIV H9) and avian pneumovirus(APV) by duplex RT-PCR was developed.Two pairs of primers were designed and synthesized base on HA gene of AIV H9 and the F gene of APV after comparisons by Blast.Duplex RT-PCR was set to detect AIV H9 and APV with two pair of primers,569 bp in length of AIV H9,424 bp in length of APV were amplified.Specificity test results showed that all test strains from AI H9,and APV were positive.Other pathogen strains as contrasts were negative.This duplex RT-PCR was able to detect at least 10 pg template each of AI H9 and APV.132 clinical samples collected from different chicken farms were detected by this RT-PCR. 6 of 132 samples were positive for AI H9,2 of 132 samples were positive for APV. 2 AIV H9 positive samples and 2 APV positive samples were used for PCR amplification and sequencing.Homology analysis showed 100% homology with AIV H9 (No.JF715045.1)and APV(No.AF187154).A rapid and specific method was set to detect AIV H9 and APV.

Avian influenza virus H9 subtype; Avian pneumovirus; duplex RT-PCR; detection

2016-05-16

广西科技厅专项(桂科AD16380009,桂科合14123001-8，桂科重14121003-4-2，桂科专项16-1)；广西自然科学基金项目(2013GXNSFDA019015)；国家万人计划领军人才专项(2016-37)

谢志勤(1965-)，男，广西苍梧人，研究员，硕士，主要从事兽医分子生物学研究。*通讯作者

S852.659.5

A

1007-5038(2016)12-0007-06