胡丽婵 郭 艺 孙祺章 余国汉 黄月玲 戴丽军 党亚梅 黄 雄陈盛强 黄海樱

Fmr1基因敲除小鼠悬尾实验的观察

胡丽婵1郭 艺2孙祺章1余国汉1黄月玲3戴丽军3党亚梅1黄 雄1陈盛强2黄海樱2

1 广州医科大学附属脑科医院，广州市惠爱医院（广州510370）2 广州医科大学附属第二医院（广州510260）3 广州医科大学实验动物中心（广州510182）

目的 对不同周龄的KO小鼠与WT小鼠进行悬尾实验进行观察，探讨KO小鼠与WT小鼠的行为差别。方法 采用健康的试验动物180只分两组：①KO组（4、6、8周龄，各周龄30只，雌雄各半，共90只）②WT组（4、6、8周龄，各周龄30只，雌雄各半，共90只）；通过悬尾实验观察性别，年龄对不动时间的影响。结果同龄KO雌性小鼠比雄性小鼠的静止时间差别不大；随着年龄增大，静止时间增长。同龄同性别的KO鼠比WT鼠的不动时间长。P＜0.05；同龄雄性小鼠比雌性小鼠的不动时间短；随年龄增长各种系小鼠不动时间增长，KO鼠的不动时间比WT鼠长，P＜0.05。结论 KO小鼠存在抑郁行为表型。

悬尾实验 脆性X综合征 抑郁行为

脆性X综合征（fragile X syndrome，FXS）是最常见的遗传性智力低下性疾病之一，发病率仅次于Down综合征，占非特异性智力低下的2%～6%，在X连锁智力低下中占40%。其致病基因—FMR1基因（fragile Xmental retardation 1）三核苷酸重复序列异常扩增导致编码产物脆性X智力低下蛋白（fragile X mentalretardation protein，FMRP）减少或缺失。FXS患者存在有不同程度的智力低下、记忆力缺失、注意力障碍、视觉运动整合障碍、癫痫发作、性格改变、孤独、活动过度、自闭、感觉过敏、巨睾症和生殖能力差、特殊面容和焦虑等行为的异常。1992年Verkerk等成功克隆出其致病基因——FMR1。基因敲除是将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的技术。1994年FMR1基因敲除小鼠的出现是FXS研究的一个里程碑。国外早有研究表明：Fmr1基因敲除小鼠（Fmr1 knockoutmice，KO鼠）具有类似于脆性X综合症的临床表现，故其为研究人类FXS的理想模型。Fmr1基因敲除鼠缺乏正常的Fmr1蛋白，表现巨睾症、记忆力缺失、行为异常和智力低下、生殖能力差。目前，FXS小鼠模型的行为学研究主要集中在学习记忆能力、活动、社会关系、焦虑、运动能力、感觉刺激特异反应等方面。悬尾实验是将动物头部向下悬挂，动物为克服不正常体位，首先产生以逃避为导向的剧烈挣扎运动，在经过努力仍不能摆脱困境后，出现间断性不动，显示“行为绝望”状态［1-4］。绝望行为反映了一种被称之为“行为绝望状态”。这种行为绝望类似于人类抑郁症的成分［5-7］，不动状态潜伏期可以作为FST评价实验动物抑郁样绝望行为一致性的稳定参数。本研究主要探讨KO鼠是否有抑郁样绝望行为，希望进一步揭示FXS的行为学，试图为深入临床研究脆性X综合征患者的行为表型及护理治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Fmr1基因敲除型（KO）纯合子（-/-）及其野生型（WT）纯合子（+/+）FVB近交系小鼠是荷兰伊拉斯塔斯大学细胞生物学及遗传学研究中心Oostra BA教授赠送，由广州医科大学实验动物中心饲养及繁殖。本研究实验动物的操作及饲养程序符合广东省和广州医科大学实验动物管理饲养规范，遵照医学伦理原则。

1.2 实验仪器 悬尾实验装置及其分析系统，购买自四川成都泰盟科技有限公司。TST技术指标：自动观测通道数：小鼠6道；采样率：最大30 fps；图像分辨率：640×480；单道尺寸：小鼠：300 mm（L）×200 mm（W）×350 mm（H）。

1.3 实验方法 通过将小鼠尾巴末端约1cm处用胶布固定在磁铁上，使其头向下悬挂，同时要注意保证小鼠在悬挂时身体除了尾巴和仪器接触外其他部位不能与悬尾仪接触，记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态过程中的一系列参数，主要观察指标：静止时间、活动时间、静止时间百分比、活动时间百分比。

1.3 统计方法 所有结果均用表示，用SPSS 18.0统计软件分析；KO与WT鼠旷场行为比较用独立样本t检验，KO或WT鼠3个组间比较采用单因素方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 小鼠鉴定结果 实验前采用聚合酶链式反应（PCR）技术鉴定FMR1基因敲除型小鼠（KO小鼠）和野生型小鼠（WT小鼠），以确保KO小鼠和WT小鼠准确性，减少误差。KO和WT小鼠基因PCR扩增结果见图1。经PCR在KO小鼠扩增出约为800 bp的DNA片断；在WT小鼠扩增出约为468 bp的DNA片断。

图1 KO和WT小鼠Fmr1基因片断PCR扩增结果

在实验前要先采用聚合酶链式反应（PCR）技术对KO小鼠和WT小鼠进行基因型鉴定，实验动物品种正确。

2.2 悬尾实验结果 该实验用时为5分钟，观测窗宽100，观测窗高140，降噪参数10，活动阈值15。实验动物数量为30只四周龄KO小鼠，其中雄雌各半和30只四周龄WT小鼠，其中雄雌各半；30只六周龄KO小鼠，其中雄雌各半和30只六周龄WT小鼠，其中雄雌各半；30只八周龄KO小鼠，其中雄雌各半和30只八周龄WT小鼠，其中雄雌各半。同组小鼠进行不同实验应相隔2天。经过图像运动解析仪、图像采集分析仪自动检测小鼠运动状况得出的实验数据经过整理分析，各组小鼠悬尾实验的结果见表1。

表1 各组小鼠悬尾实验结果

实验结果显示：同龄同性别的KO鼠比WT鼠的静止时间长（P＜0.05）。同龄KO雌性小鼠比雄性小鼠的静止时间长，但差别不大（P＞0.05）。随年龄增长各种系小鼠静止时间时间增长，但KO鼠的静止时间仍比WT鼠长（P＜0.05）。

3 讨 论

脆性X综合征（fragile X syndrome）是脆性X综合症（FXS）由于缺乏FMRP蛋白的表达导致智能减退和多动症。

悬尾实验，是一种抗抑郁药物活性筛选非常灵敏的行为学检测方法，也可用于抑郁症病理生理机制的研究。因其快速、方便，自1985年提出至今，被广为接受和应用。目前普遍认为，这种行为绝望类似于人类抑郁症的成分。早期悬尾实验，以人工计时居多，工作量大，客观性不强，不能定量分析动物的挣扎强度。随着信息、计算机、电子工程等技术和药理学的交叉融合，其自动化测量方法也逐渐发展起来。我们所用的悬尾实验的数据采集由图像运动解析仪，图像采集分析仪自动检测小鼠运动状况，实现了实验过程的自动化，可以提取客观定量数据，避免了人工计数引入的主观误差和对实验动物的干扰，增加了实验结果的客观性、可靠性。比以往人工观察更加灵敏，客观。可以更加全面地评价动物活动特点，且实验不存在时间效应，即一天当中不同时间进行试验，结果是基本一致的。

社交异常、焦虑是FXS患者常见的表现［8-9］。本实验对4～8周龄的KO与WT鼠进行悬尾实验行为观察，发现同龄同性别的KO鼠比WT鼠的静止时间长。同龄KO雌性小鼠比雄性小鼠的静止时间长，但差别不大。随年龄增长各种系小鼠静止时间时间增长，但KO鼠的静止时间仍比WT鼠长。提示KO鼠这种行为绝望类似于人类抑郁症的成分，具有抑郁症样行为。与国外的［10-11］研究结果一致，因此对FXS患者的治疗不单要给与药物，还要在护理上密切注意情绪的观察和关怀。

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Observation of tail suspension test in Fm r1 gene knockoutm ice

Hu Lichan，Sun Qizhang，Yu Guohan，et al.The Brain Hospital affiliated to Guangzhou Medical University，Guangzhou 510370，China
Guoyi，Chen Shengqiang，Huang Haiying，etal.Instituteof Neuroscience of the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China
Huang Yueling，Dai Lijun.The Laboratory Animal Research Center of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China

Objective To observe tail suspension test in Fmr1 gene knockoutmice and to explore whether there are differences inmobility of KO and WTmice. Methods 180 testmice were divided into two groups：①KO group（4，6，8 weeks old，each age group ofmice is30，male and female in half，a total of90）②WT group（4，6，8 weeks old，each group ofmice is30，male and female on half，a total of90）.Through forced swimming testand tail suspension test to observe gender，age effect on immobility time. Resu lts With the same age of the same sex，the KO mice's immobility time was longer than WTmice's.P＜0.05.With the same age，the male mice's immobility time was shorter than femalemice's.With the age increase，the immobility time of KO mice was longer than WT mice.P＜0.05. Conclusion Fmr1 gene knockoutmice have anxiety and depressive behavior.

Fragile X Syndrome；Tail suspension test；Depressive behavior

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.003

2016-04-01）

广东省科技计划项目（2013B021800075，2015A0030302090）；广州市科技计划项目（2014Y2-00046）；广东省中医药局项目（B1533015）；广东市卫生局科技项目（20141A10020，20151A011080）

郭艺，E-mail：chenshengq66@gmail.com