张 立， 张 迪， 李孝彬， 王 炜， 孙学军， 李 杰， 李军辉

(1西安交通大学第二附属医院普外科，西安 710004；2西安交通大学第一附属医院普外科；*通讯作者，E-mail:ljh991049@126.com)



microRNA-616在肝细胞性肝癌中表达及对上皮-间质转化的影响

张 立， 张 迪， 李孝彬， 王 炜， 孙学军， 李 杰， 李军辉

(1西安交通大学第二附属医院普外科，西安 710004；2西安交通大学第一附属医院普外科；*通讯作者，E-mail:ljh991049@126.com)

目的 研究microRNA-616(miR-616)在肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)组织中的表达，探讨其与HCC上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的关系及临床意义。 方法 用实时定量PCR检测40例HCC组织及癌旁组织及人正常肝细胞株LO2和6种HCC细胞株Hep3B、HepG2、Huh7、MHCC97L、HCCLM3和MHCC97H中miR-616表达。经细胞转染分别在Hep3B细胞中过表达miR-616及在MHCC97H细胞沉默miR-616，通过Western blot、荧光素酶报告检测方法了解相应HCC细胞中miR-616、E-cadherin及vimentin的表达情况。 结果 与对应的癌旁组织相比，miR-616在肿瘤组织中的表达水平显著升高(0.031±0.043vs0.12±0.078,P<0.01)。所有6种HCC细胞株的miR-616表达水平均显著高于人正常肝细胞株LO2(P<0.01)。在Hep3B细胞中过表达miR-616，可降低E-cadherin表达水平(P<0.01)，增加vimentin的表达(P<0.01)。在MHCC97H细胞中抑制miR-616的表达，可增加E-cadherin的表达水平(P<0.01)，降低vimentin表达(P<0.01)。 结论 miR-616可作为HCC一种有价值的临床生物标志物，靶向干预miR-616，可影响HCC的EMT。

microRNA-616； 肝细胞性肝癌； 上皮-间质转化； 肿瘤转移

肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的全球发病率位居恶性肿瘤的第5位，在我国居第2位[1]。虽然在HCC研究方面取得了显著的成就[2]，但HCC患者的长期预后仍然较差，局部和全身转移是晚期HCC患者生存期不理想的重要原因[3]。阐明HCC转移的分子机制，对于确定新的治疗靶点有重要的作用。

在人类恶性肿瘤中，microRNA的异常表达和功能扮演着重要角色[4-6]。此外，microRNA现已成为有前途的诊断和预后标志物以及人类癌症的有吸引力的治疗靶点[7,8]。microRNA-616(miR-616)被发现是一种新的肿瘤相关microRNA，并且研究中发现miR-616在胃癌[9]、肺癌[10]和前列腺癌[11]患者血清中明显升高，然而，miR-616在HCC中的表达情况以及在HCC细胞中的潜在作用机制，目前仍需进一步研究。

上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞失去极性，经过细胞骨架重塑转变成具有迁移能力的间充质表型的过程。多项研究证实，EMT是肿瘤侵袭转移的一个重要步骤[12]，且EMT被认为是肿瘤转移的标志[13]，可以增加HCC的迁移及侵袭能力[14]，其主要的特征为通过Wnts和Notch信号通路，致使E-cadherin表达减少、vimentin增加。

本研究通过检测miR-616在HCC组织及不同分化的HCC细胞系的表达，初步探讨HCC中miR-616的表达情况及对EMT的影响。

1 材料和方法

1.1 肿瘤组织标本来源

收集2006-01～2009-12期间于西安交通大学附属第一、二医院40例HCC患者的肿瘤组织及癌旁组织(规定距癌组织2 cm以上)，患者接受手术切除前未接受任何抗肿瘤治疗。所有组织标本均保存于液氮备用。本实验与所有患者或家属进行充分沟通并签署试验知情同意书。

1.2 细胞株及细胞培养

人正常肝细胞株LO2及6种HCC细胞株Hep3B、HepG2、Huh7、MHCC97L、HCCLM3和MHCC97H(购自中国科学院上海细胞库)，均培养于DMEM培养基(购自HyClone，含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)中。将对数生长的细胞悬液均匀地分布于25 cm×25 cm细胞培养瓶中，其中含5 ml培养液，细胞密度为5×104个/ml，每周传代2次，置于5% CO2、37 ℃的孵箱中培养。

1.3 实时定量PCR(qPCR)分析miR-616表达情况

利用Trizol(购自Life Technologies)从HCC组织或细胞提取总RNA。使用TaqMan microRNA逆转录试剂盒(购自Applied Bio systems)对miR-616进行定量PCR扩增，U6作为内参照。结束后经CFX Manage软件(美国Bio-Rad)分析，采用2-ΔCt方法计算miR-616相对表达量。

1.4 细胞转染Hep3B及MHCC97H细胞

miR-616表达载体(HmiR0186-MR04)、miR-616对照载体(CmiR0001-MR04)、miR-616抑制剂(HmiR-AN0721-AM03)和miR-616抑制剂阴性对照(CmiR-AN0001-AM03)，均购自中国GeneCopoeia。上述载体插入SMAD7质粒(pCMV5-SMAD7，购自美国Addgene公司)。用Lipofectamine 2000(购自美国Invitrogen公司)技术将SMAD7质粒转染Hep3B及MHCC97H细胞并进行相关检测。

1.5 Western blot实验检测EMT

取转染后的Hep3B及MHCC97H细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗2次，用RIPA裂解缓冲液(购自Bio-Med公司)抽提蛋白。利用BCA法测定蛋白浓度，每孔加样30 μg，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并转移到PVDF膜。加入一抗稀释液(购自美国Cell Signaling)：E-cadherin (1 ∶1 000)、vimentin (1 ∶1 000) 和β-actin(1 ∶1 500)，4 ℃过夜。 TBST漂洗膜后，每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1∶10 000；购自美国Bio-Rad公司)室温孵育，并用凝胶成像系统检测(美国Bio-rad公司)，Image-Pro Plus软件分析吸光度(A)值。β-actin作为内参，实验重复3次。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 HCC组织及细胞中miR-616的表达显著升高

与对应的癌旁组织相比，miR-616在40例HCC组织中的相对表达显著升高(0.031±0.043vs0.12±0.078，P<0.01，图1A)。

HCC细胞株Hep3B、HepG2、Huh7、MHCC97L、HCCLM3及MHCC97H和人正常肝细胞株LO2相比，6种HCC细胞株的miR-616表达水平均显著高于人正常肝细胞株LO2(Hep3B:1.78±0.08,HepG2:1.82±0.09,Huh7:1.61±0.04,MHCC97L:2.32±0.10,HCCLM3:4.35±0.15,MHCC97H:4.41±0.16vsLO2:1.02±0.05,P<0.01)；并且HCCLM3及MHCC97H两种高转移特性HCC细胞株的miR-616表达水平又明显高于低转移特性Hep3B、HepG2、Huh7和MHCC97L细胞株(P<0.01，见图1B)。说明miR-616在HCC中明显升高，且与其转移特性具有相关性。

图1 MiR-616在HCC组织及各细胞株中的表达Figure 1 The miR-616 expression in different HCC tissues and different cells

2.2 miR-616对HCC细胞EMT的影响

在低转移特性Hep3B细胞中转染HmiR0186-MR04及CmiR0001-MR04，可以看到miR-616表达水平相对于对照组明显升高(16.32±0.98vs1.01±0.05，P<0.01，见图2A)；在高转移特性MHCC97H细胞中转染HmiR-AN0721-AM03及CmiR-AN0001-AM03，可以看到miR-616表达水平相对于对照组明显降低(1.05±0.09vs7.23±1.01，P<0.01，见图2B)。

在Hep3B细胞中过表达miR-616后，E-cadherin的表达水平显著降低(1.00±0.01vs0.33±0.02，P<0.01)和vimentin表达增加(1.01±0.02vs3.78±0.52，P<0.01,见图3)。在MHCC97H细胞中抑制miR-616的表达，E-cadherin的表达水平显著升高(1.03±0.01vs2.73±0.22，P<0.01)和vimentin表达降低(1.03±0.01vs0.21±0.02，P<0.01，见图4)。这些结果表明，HCC细胞中miR-616可以促进其EMT。

图2 HCC细胞进行相关转染后miR-616的表达情况Figure 2 The expression of miR-616 in different HCC cells after transfection

图3 miR-616对于HCC细胞中E-cadherin及vimentin的影响Figure 3 Effects of miR-616 on E-cadherin and Vimentin in HCC cells

图4 沉默miR-616后MHCC97H细胞中E-cadherin及vimentin表达Figure4 Expression of E-cadherin and Vimentin in MHCC97H cells after miR-616 silencing

3 讨论

HCC的发生发展过程中有各种分子和众多的信号转导通路参与[15,16]。研究证实，microRNA的异常表达和功能在这个过程中发挥了关键作用[17]。microRNA是高度保守的含有19-24核苷酸序列的RNA分子，它能够通过特异性结合mRNA，在转录后水平影响基因表达。

EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，肿瘤的浸润生长存在EMT现象，可使肿瘤细胞表型改变，从而使其获得浸润和转移的能力[18]，而E-cadherin和vimentin分别是上皮细胞和间质细胞的重要生物标志物[19]。在胰腺癌[18]、乳腺癌[20]、前列腺癌[21]、宫颈癌[22]、肺癌[23]等研究中发现，E-cadherin表达降低，vimentin表达上升，表明肿瘤中存在E-cadherin向vimentin转化的EMT现象。

本研究初步观察了HCC中的miR-616表达情况。HCC与对应癌旁组织之间miR-616表达水平存在差异(P<0.01)；HCCLM3及MHCC97H细胞株具有高转移性，而Hep3B、HepG2、Huh7和MHCC97L为低转移HCC细胞株。高、低转移特性HCC细胞株及人正常肝细胞株LO2之间miR-616表达的差异具有统计学意义，HCC细胞株的miR-616表达高于LO2细胞株，而具高移特性HCC细胞株的miR-616表达又高于低转移特性HCC细胞株(P<0.01)，该结果提示，miR-616可以增强HCC细胞的侵袭能力。而EMT被认为是肿瘤转移的标志[13]，EMT增加可以促进HCC的迁移及侵袭能力[14]。本研究在低转移特性的Hep3B细胞中过表达miR-616，可降低E-cadherin的表达(P<0.01)和增加vimentin的表达(P<0.01)，说明高表达miR-616可以促进Hep3B的EMT，也就可认为促进HCC的迁移及侵袭能力；在MHCC97H细胞中抑制miR-616的表达，可增加E-cadherin的表达(P<0.01)和降低vimentin的表达(P<0.01)，说明低表达miR-616可以抑制MHCC97H的EMT，也就可认为降低HCC的迁移及侵袭能力。该结果表明，miR-616可以通过EMT而改变HCC的转移能力。

而以往研究发现Snail、Zeb等转录因子及GATA3抑制转录因子相互反馈作用而影响EMT[24]，且相关研究中发现miRNA可通过靶向EMT中的转录因子而改变肿瘤的转移和侵袭能力，p53可诱导miR-34a和miR-192，进而抑制Snail-1和Zeb-2的表达，阻止EMT进程，而miR-200通过抑制转录因子GATA3的表达促进EMT进程。而本实验中miR-616对于EMT信号通路的影响，可能与GATA3相关，需要在进一步研究中予以发现证实。

综上所述，本研究结果从临床病理资料及体外细胞转染实验的水平表明，在HCC中miR-616的表达明显升高，并且与EMT相关。因此，miR-616可以作为一种有价值的临床标志物，靶向干预miR-616，可以影响HCC的EMT，从而影响其迁移及侵袭能力。

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2] Karaman B,Battal B,Sari S,etal.Hepatocellular carcinoma review:current treatment,and evidence-based medicine[J].World J Gastroenterol,2014,20(47):18059-18060.

[3] Roberts LR.Sorafenib in liver cancer-just the beginning[J].N Engl J Med,2008,359(4):420-422.

[4] Garzon R,Calin GA,Croce CM.MicroRNAs in cancer[J].Annu Rev Med,2009,60:167-179.

[5] Jansson MD,Lund AH.MicroRNA and cancer[J].Mol Oncol,2012,6(6):590-610.

[6] Ladeiro Y,Couchy G,Balabaud C,etal.MicroRNA profiling in hepatocellular tumors is associated with clinical features and oncogene/tumor suppressor gene mutations[J].Hepatology,2008,47(6):1955-1963.

[7] Giordano S,Columbano A.MicroRNAs:new tools for diagnosis,prognosis,and therapy in hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2013,57(2):840-847.

[8] Cho WC.MicroRNAs:potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,42(8):1273-1281.

[9] Yao Y,Suo AL,Li ZF,etal.MicroRNA profiling of human gastric cancer[J].Mol Med Rep,2009,2(6):963-970.

[10] Rani S,Gately K,Crown J,etal.Global analysis of serum microRNAs as potential biomarkers for lung adenocarcinoma[J].Cancer Biol Ther,2013,14(12):1104-1112.

[11] Ma S,Chan YP,Kwan PS,etal.MicroRNA-616 induces androgen-independent growth of prostate cancer cells by suppressing expression of tissue factor pathway inhibitor TFPI-2[J].Cancer Res,2011,71(2):583-592.

[12] Micalizzi DS,Farabaugh SM,Ford HL.Epithelial-mesenchymal transition in cancer:parallels between normal development and tumor progression[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia,2010,15(2):117-134.

[14] Reichl P,Haider C,Grubinger M,etal. TGF-β in epithelial to mesenchymal transition and metastasis of liver carcinoma[J].Curr Pharm Des,2012,18(27):4135-4147.

[15] Roberts LR,Gores GJ.Hepatocellular carcinoma:molecular pathways and new therapeutic targets[J].Semin Liver Dis,2005,25(2):212-225.

[16] Aravalli RN,Steer CJ,Cressman EN.Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2008,48(6):2047-2063.

[17] Jiang J,Gusev Y,Aderca I,etal.Association of microRNA expression in hepatocellular carcinomas with hepatitis infection,cirrhosis,and patient survival[J].Clin Cancer Res,2008,14(2):419-427.

[18] Cano CE,Motoo Y,Iovanna JL.Epithelial-to-mesenchymal transition in pancreatic adenocarcinoma[J].Sci World J,2010,10(1):1947-1957.

[19] Kokkinos MI,Wafai R,Wong MK,etal.Vimentin and epithelial-mesenchymal transition in human breast cancer-observations in vitro and in vivo[J].Cells Tissues Organs,2007,185(1-3):191-203.

[21] Yang Y,Zhang X,Song D,etal.Piwil2 modulates the invasion and metastasis of prostate cancer by regulating the expression of matrix metalloproteinase-9 and epithelial-mesenchymal transitions[J].Oncol Lett,2015,10(3):1735-1740.

[22] Tang Y,Wang Y,Chen Q,etal.MiR-223 inhibited cell metastasis of human cervical cancer by modulating epithelial-mesenchymal transition[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(9):11224-11229.

[23] 田茗源，王林辉，张雄，等.肺癌组织中E-cadherin和Vimentin的表达及其与上皮-间质转化的相关性[J].中国生物制品学杂志，2011，24(9):1068-1071.

[24] Zheng H,Kang Y.Multilayer control of the EMT master regulators[J].Oncogene,2013,33(14):1755-1763.

Expression of microRNA-616 and its effects on epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma

ZHANG Li1, ZHANG Di1, LI Xiaobin2, WANG Wei2, SUN Xuejun2, LI Jie1, LI Junhui1*

(1DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:ljh991049@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-616(miR-616) in hepatocellular carcinoma(HCC), and to explore its relationship with epithelial-mesenchymal transition(EMT) of HCC and its clinical significance.MethodsThe miR-616 expression was detected by real-time quantitative PCR method in specimens of primary cancer and their adjacent non-cancerous tissues from 40 HCC patients and in HCC cells with different differentiation degree. The miR-616 was transfected into Hep3B cells and miR-616 inhibitor was transfected into MHCC97H cells, and then the expression of miR-616 was detected by luciferase reporter assay and the levels of E-cadherin, vimentin were detected by Western blot.ResultsThe expression level of miR-616 in tumor tissues was significantly higher than that of the corresponding adjacent cancer tissues(0.12±0.078vs0.031±0.043,P<0.01). The expression level of miR-616 was significantly higher in 6 kinds of HCC cells than in normal human liver cell line L02(P<0.01). The expression level of E-cadherin was reduced and vimentin was elevated in Hep3B cells with miR-616 overexpression vector transfected(P<0.01). The expression level of E-cadherin was elevated and vimentin was reduced in MHCC97H cells transfected with miR-616 inhibitor(P<0.01).ConclusionMiR-616 can be used as a valuable biomarker for HCC, and it can affect the EMT of HCC by targeting miR-616.

microRNA-616; hepatocellular carcinoma; epithelial-mesenchymal transition; tumor metastasis

陕西省社会发展科技攻关基金资助项目(2016SF-137)

张立，男，1979-02生，博士，主治医师

2016-05-30

R735.7

A

1007-6611(2016)09-0795-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.003