霍建华， 马爱群， 郭雪艳， 强 华， 刘 平， 白 玲

(1西安交通大学医学院第一附属医院心内科，西安 710061； 2陕西省人民医院消化科; *通讯作者,E-mail:maaiqun@medmail.com.cn)



绿色荧光蛋白基因与hERG基因G604S突变共表达功能研究

霍建华， 马爱群， 郭雪艳， 强 华， 刘 平， 白 玲

(1西安交通大学医学院第一附属医院心内科，西安 710061；2陕西省人民医院消化科;*通讯作者,E-mail:maaiqun@medmail.com.cn)

目的 观察增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因与hERG(human ether-a-go-go-related gene)基因融合后是否影响hERG通道的电生理特性。 方法 HEK293细胞分别被转入pcDNA3-WT-hERG和/或pcDNA3-G604S-hERG，pEGFP-WT-hERG和/或pEGFP-G604S-hERG。激光共聚焦观察hERG通道蛋白在细胞内的表达定位；膜片钳实验记录hERG电流。 结果 在转染pcDNA3-WT-hERG或pEGFP-WT-hERG的细胞中，hERG蛋白表达于胞质与胞膜；在转染pcDNA3-G604S-hERG或pEGFP-G604S-hERG的细胞中，hERG蛋白仅在胞质表达。HEK293细胞转染pcDNA3-WT-hERG后，hERG电流的最大尾电流密度为(75.4±2.2)pA/pF，明显高于转染pEGFP-WT-hERG的最大尾电流密度[(15.1±0.7)pA/pF，P<0.05]。共转染pcDNA3-WT-hERG与pcDNA3-G604S-hERG的最大hERG尾电流密度明显高于pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG的最大hERG尾电流密度[(23.1±0.8)pA/pFvs(12.6±0.9)pA/pF，P<0.05]。此外，EGFP基因与野生型或突变hERG基因融合后，明显改变了hERG通道的电压依赖性激活及去失活特性。 结论 EGFP基因与野生型或突变hERG基因融合不影响hERG通道蛋白在细胞内的表达定位，但明显改变了hERG电流的大小、激活及去失活特性，因此检测突变hERG通道的电生理功能时应避免使用绿色荧光蛋白基因质粒作为表达载体。

增强型绿色荧光蛋白； hERG； G604S突变； HEK293

先天性长QT综合征(congenital long QT syndrome, cLQTS)是由编码心脏离子通道或离子通道相关蛋白的基因突变导致相应的离子通道功能异常，从而引起心电图QT间期延长、T波异常，易产生室性心律失常，尤其是尖端扭转性室速，并导致晕厥和猝死的一组综合征。hERG基因(human ether-a-go-go-related gene)突变引起2型先天性长QT综合征[1-4]。hERG基因G604S突变(hERG蛋白第604位甘氨酸被丝氨酸替代)是西安交通大学环境与疾病相关基因实验室前期在一个中国LQTS家系中发现的突变[5]。利用全细胞膜片钳及免疫荧光细胞化学观察G604S突变引起hERG功能丧失(G604S突变引起hERG电流丧失，通道蛋白出现转运障碍，即只表达在细胞质中，而细胞膜上无表达)，且对野生型hERG基因明显的负显性抑制作用[6]。增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)作为常用的分子标记物，可与其他目的基因形成融合蛋白，用于分析目的基因在细胞内或机体内的表达位置及量的变化，EGFP目前已成为生物化学和细胞生物学中研究和开发应用最为广泛的分子之一[7,8]。近年来在先天性长QT综合征相关基因突变的致病机制研究中，将突变目的基因插入到EGFP基因表达载体中组成绿色荧光融合蛋白重组质粒，在荧光显微镜下直接观察突变目的基因在细胞内的表达定位，但其对离子通道电流表达是否有影响还需进一研究。本研究主要观察将EGFP基因与野生型及G604S突变hERG基因组成融合基因，观察EGFP蛋白对hERG通道蛋白在细胞内定位及对hERG电流表达的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂与仪器

HEK293细胞株由西安交通大学环境与疾病相关基因实验室提供质粒pcDNA3-WT-hERG由美国Wisconsin大学Blake D.Anson博士惠赠，pcDNA3-G604S-hERG由西安交通大学环境与疾病相关基因实验室前期构建，pEGFP-WT-hERG及pEGFP-G604S-hERG均利用酶切法分别由pcDNA3-WT-hERG、pcDNA3-G604S-hERG和pEGFP-C2构建成功。脂质体2000试剂盒购自美国Invitrogen公司。抗体Anti-K11.1(hERG)及FITC标记山羊抗兔二抗购自以色列Alomone公司。TCS SP2型激光扫描共聚焦显微镜为德国Leica公司产品。Axon-700B单探头膜片钳放大器、DigiData-1322A数模转换装置及pCLAMP9.2 膜片钳数据处理软件均为美国Axon公司产品。

1.2 HEK293细胞的转染

转染前一天，HEK293细胞铺在6孔板中，培养基为含有10%胎牛血清、不含抗生素的高糖DMEM；转染时细胞密度为60%-70%(膜片钳实验)或20%-30%(激光共聚焦实验)；转染程序按照脂质体2000试剂说明进行。细胞分别被转入pcDNA3-WT-hERG和/或pcDNA3-G604S-hERG，pEGFP-WT-hERG和/或pEGFP-G604S- hERG。48 h后立即进行膜片钳及激光共聚焦实验。

1.3 激光共聚焦观察hERG通道蛋白在细胞中的定位

增强型绿色荧光表达载体观察hERG通道蛋白在细胞中的定位： 6孔板中放入预先经多聚赖氨酸处理过的盖玻片，将HEK293细胞放在盖玻片上，继续生长12 h；将绿色荧光表达载体pEGFP-WT-hERG和/或pEGFP-G604S-hERG转染入HEK293细胞；48 h后立即弃去培养基，利用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光表达。免疫荧光细胞化学观察hERG通道蛋白在细胞中的定位：将真核表达载体pcDNA3-WT-hERG或/和pcDNA3-G604S-hERG转染入HEK293细胞；48 h后立即用4%多聚甲醛固定，0.3%的Triton X-100室温下打孔，一抗兔抗人HERG单克隆抗体(1∶100)和二抗FITC标记羊抗兔IgG(1∶100)标记后激光共聚焦显微镜上观察绿色荧光表达。1.4 全细胞膜片钳技术检测hERG通道电生理功能使用全细胞膜片钳技术记录HEK293细胞表达电流。pCLAMP9.2软件记录电流。细胞外液(mmol/L)：137 NaCl，4 KCl，1.8 CaCl2，1 MgCl2，10 Glucose，10 HEPES(pH 7.4)。电极内液(mmol/L)：130 KCl，1 MgCl2，5 EGTA，5 MgATP，10 HEPES(pH 7.2)。实验在室温(23±1)℃中完成。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 激光共聚焦观察hERG通道蛋白在细胞中的定位

HEK293细胞转染进不同质粒48 h后立即激光共聚焦显微镜观察hERG通道蛋白的表达和定位,结果显示转染pcDNA3-WT-hERG或pEGFP-WT-hERG的细胞，hERG通道蛋白不但在细胞质里表达，而且在细胞膜上有表达；转染pcDNA3-G604S-hERG或pEGFP-G604S-hERG的细胞，hERG通道蛋白只表达在细胞质中，而细胞膜上无绿色荧光表达(见图1)，说明突变可以引起通道蛋白的转运障碍。当共转染pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG或pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG时，细胞膜上绿色荧光较只转染野生型hERG时明显减弱，说明G604S突变减弱hERG通道在细胞膜上的表达。以上结果说明EGFP/hERG融合蛋白并不影响hREG蛋白在细胞内的转运与定位，与免疫荧光细胞化学法观察hERG通道蛋白在细胞内的转运定位相一致，说明EGFP基因表达载体可以作为hERG通道蛋白在细胞内转运定位的标记工具。

图1 激光共聚焦显微镜定位hERG通道蛋白在HEK293细胞内的定位Figure 1 Confocal imaging of hERG channels in HEK293 cells

2.2 全细胞膜片钳技术检测转染后细胞的hERG电流

HEK293细胞转染进不同质粒48 h后立即全细胞膜片钳记录hERG电流,从图2A-图2F可以看出转染pcDNA3-WT-hERG或pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG的细胞电流形态一致；转染pEGFP-WT-hERG或pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG的细胞电流形态相同，但它们的尾电流明显小于转染pcDNA3-WT-hERG或pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG的细胞电流。转染pcDNA3-G604S-hERG或pEGFP-G604S-hERG的细胞未检测到hERG电流。图2G是激活电流的I-V曲线，可以看出pcDNA3-WT-hERG的最大激活电流密度为(46.5±2.5)pA/pF(n=10)，而pEGFP-WT-hERG的最大激活电流密度为(45.4±6.4)pA/pF(n=10)，两者差异无统计学意义(P>0.05)；pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG的最大激活电流密度为(14.3±0.5)pA/pF(n=10)，而pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG的最大电流密度为(15.4±1.8)pA/pF，两者差异无统计学意义(P>0.05，n=10)。图2H是尾电流的I-V曲线，可以看出在pcDNA3-WT-hERG的最大尾电流密度为(75.4±2.2)pA/pF(n=10)，明显高于pEGFP-WT-hERG的最大尾电流密度[(15.1±0.7)pA/pF，P<0.05，n=10]。pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG的最大尾电流密度明显高于pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG[(23.1±0.8)pA/pFvs(12.6±0.9)pA/pF，P<0.05，n=10]。以上结果说明绿色荧光融合蛋白并不影响hERG激活电流，而明显减小hERG尾电流。

2.3 绿色荧光融合蛋白对hERG通道电生理特性的影响

将尾电流标准化后，再用Boltzmann方程进行拟合,转染不同质粒细胞尾电流拟合曲线显示，pcDNA3-WT-hERG组半激活电压(V1/2)为(-15.1±1.1)mV(n=10)，pEGFP-WT-hERG组半激活电压为(-8.7±0.7)mV(n=9)，两组相比有显著性差异(P<0.05,见图3)。pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG组半激活电压(V1/2)为(-15.8±1.3)mV(n=10)，pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG组半激活电压为(-7.7±0.7)mV(n=10)，两组相比有显著性差异(P<0.05)。以上结果说明绿色荧光融合蛋白可改变hERG通道的电压依赖性激活特性。

图2 hERG电流的激活电流和尾电流I-V曲线Figure 2 I-V relationships for amplitudes of activation currents and tail currents of hERG recorded during test pulses

图4A-图4D所示的是膜片钳记录的不同组hERG电流的去失活部分，可以看出pcDNA3-WT-hERG组电流的去失活部分明显大于其他三组。将去失活电流进行双指数方程拟合后得出快去失活时间常数和慢去失活时间常数。图4E-图4F所示的是在不同命令电压下不同组别的快去失活时间常数及慢去失活时间常数。从图中可看出，在不同的命令电压下，pcDNA3-WT-hERG组和pcDNA3-WT-hERG/pcDNA3-G604S-hERG组的快去失活时间常数及慢去失活时间常数明显大于pEGFP-WT-hERG组和pEGFP-WT-hERG/pEGFP-G604S-hERG组(P<0.05)，说明绿色荧光融合蛋白加速了hERG电流的去失活。

图3 不同命令电压下最大尾电流经Boltzmann方程拟合后曲线Figure 3 Amplitudes of tail currents plotted as a function of the test potential and fitted to a Boltzmann function

图4 HEK293细胞转染不同质粒后表达的hERG电流的去失活特性Figure 4 Deactivation of expressed currents in HEK293 cells transfected with different plasmids

3 讨论

HERG基因G604S突变是我们前期在一个中国LQTS家系中发现的国内新突变[5]。本研究利用EGFP基因与hERG基因融合技术观察到：EGFP/hERG融合蛋白并不影响hREG蛋白在细胞内的转运与定位，EGFP基因表达载体可以作为hERG通道蛋白在细胞内转运定位的标记工具；绿色荧光融合蛋白不影响hERG激活电流，而明显减小hERG尾电流；绿色荧光融合蛋白可改变hERG通道的电压依赖性激活特性及去失活特性。

检测目的基因表达蛋白在细胞内的转运和定位可采用免疫荧光细胞化学技术，此技术虽然能较准确反映目的蛋白在细胞内的表达及定位，但其缺点是须对细胞进行固定及一系列的操作处理，操作繁琐复杂。近年来广泛将EGFP其他目的基因形成重组表达载体，在荧光显微镜下直接观察细胞中目的基因表达蛋白的表达、转运和定位变化。本实验中将野生型及G604S突变hERG基因与EGFP基因进行融合表达，结果表明绿色荧光蛋白与野生型或G604S突变hERG蛋白共表达后，并不改变hERG蛋白在细胞内转运及定位，可准确反映hERG蛋白在细胞内的表达，也说明EGFP可作为野生型或突变型 hERG通道蛋白在细胞内的定位表达工具，不但操作简单准确，而且易于检测。

在HEK293细胞转染进EGFP与野生型或G604S突变hERG融合基因时，膜片钳技术检测到带有EGFP的hERG尾电流明显小于无EGFP的hERG电流，且其电压依赖性激活特性及去失活特性明显改变。本实验中pEGFP-WT-hERG及pEGFP-G604S-hERG均利用酶切法将WT-hERG和G604S-hERG连接于pEGFP-C2质粒中EGFP基因的下游端，因此EGFP被融合于hERG基因的N-端上游。既往研究显示hERG通道蛋白的N-端Per-Arnt-Sim(PAS)区与通道的去失活有明显关系。HERG基因N-端突变可引起hERG电流去失活明显加速[9,10]。本实验中EGFP融合于hERG 基因的N-端可能改变了PAS区的功能，从而加速了hERG电流的去失活。

综上所述，本研究提示增强型绿色荧光融合蛋白对野生型或突变型hERG通道蛋白的表达定位无影响，但会明显改变hERG电流的电生理功能，因此检测LQTS相关hERG基因的电生理功能时应避免使用绿色荧光蛋白基因质粒作为表达载体。

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Study on the function of co-expression of enhanced green fluorescent protein gene with congenital LQT2 relating hERG gene G604S mutation

HUO Jianhua1, MA Aiqun1*, GUO Xueyan2, QIANG Hua1, LIU Ping1, BAI Ling1

(1DepartmentofCardiovascularMedicine,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofDigestiveDiseases,ShaanxiProvincialPeople’sHospital;*Correspondingauthor,E-mail:maaiqun@medmail.com.cn)

ObjectiveTo explore the effect of EGFP tagged to hERG channels on the electrophysiological properties of hERG channels.MethodsHEK293 cells were transfected with pcDNA3-WT-hERG and/or pcDNA3-G604S-hERG, pEGFP-WT-hERG and/or pEGFP-G604S-hERG. The subcellular location of hERG channels in HEK293 cells was analyzed under confocal microscopy. And hERG currents were recorded using the voltage clamp technique.ResultsIn HEK293 cells transfected with pcDNA3-WT-hERG or pEGFP-WT-hERG, hERG channels expressed both on the cell surface and within the cytoplasm. In cells transfected with pcDNA3-G604S-hERG or pEGFP-G604S-hERG, hERG channels only expressed in the cytoplasm. The maximal density of tail currents was (75.4±2.2)pA/pF and(15.1±0.7)pA/pF in cells expressing pcDNA3-WT-hERG and pEGFP-WT-hERG, respectively(P<0.05). The maximal density of tail currents in cells co-expressing pcDNA3-WT-hERG and pcDNA3-G604S-hERG was(23.1±0.8)pA/pF, which was significantly higher than in cells co-expressing pEGFP-WT-hERG and pEGFP-G604S-hERG[(12.6±0.9)pA/pF,P<0.05]. In addition, EGFP/hERG fusion protein altered the voltage-dependent hERG channel activation and deactivation.ConclusionThe enhanced green fluorescent protein shows no effect on the transport and localization of wild-type or mutant hERG channel protein, but significantly alters electrophysiological function of hERG current. Thus, it should be avoided using EGFP as a reporter to study the electrophysiological function of hERG channel.

enhanced green fluorescent protein(EGFP); hERG; G604S mutation; HEK293

国家自然科学基金资助项目(30801133);陕西省自然科学基础研究计划基金资助项目(2014JM2-8154)

霍建华，男，1979-03生，博士，主治医师,E-mail:huojianhua2005@126.com

2016-07-01

R541.1

A

1007-6611(2016)09-0785-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.001