卢根林，　吴爱兵，　王宏宾

(1义乌市中心医院普通外一科，浙江 义乌 322000； 2广东医学院附属医院肿瘤中心，广东 湛江 523808；3青海大学附属医院肝胆胰外科, 青海 西宁 810001)



H2S通过MAPK信号通路影响缺血再灌注损伤大鼠回肠上皮细胞凋亡*

卢根林1△，吴爱兵2，王宏宾3

(1义乌市中心医院普通外一科，浙江 义乌 322000；2广东医学院附属医院肿瘤中心，广东 湛江 523808；3青海大学附属医院肝胆胰外科, 青海 西宁 810001)

目的： 建立大鼠肠缺血再灌注(I/R)损伤模型，研究H2S对I/R损伤大鼠回肠上皮细胞凋亡、MAPK信号通路表达的影响。方法: 30只雄性Wistar大鼠随机分为假手术(sham)组、I/R组、I/R+NaHS组。建立大鼠肠I/R损伤模型。再灌注前10 min时经大鼠尾静脉注入100 μmol/kg NaHS,随后按1 mg·kg-1·h-1输注直到再灌注2 h。RT-PCR检测回肠组织ERK、JNK和p38MAPK的mRNA表达， Western blot检测回肠组织p-ERK、p-JNK、p-p38MAPK、p-NF-κB P65的蛋白水平。TUNEL染色检测回肠上皮细胞凋亡。敏感硫电极法测定血、回肠组织匀浆中的H2S浓度。结果: I/R组的H2S浓度、ERK、mRNA、p-ERK均低于sham组和I/R+NaHS组，JNK mRNA、p38MAPK mRNA、p-JNK、p-p38MAPK、p-NF-κB P65和凋亡指数高于sham组和I/R+NaHS组。结论: H2S通过下调ERK的mRNA表达及磷酸化，上调JNK、p38MAPK mRNA的表达，促进JNK、p38MAPK、NF-κB磷酸化，从而减轻I/R 损伤大鼠的回肠上皮细胞凋亡。

缺血再灌注损伤； 硫化氢； MAPK信号通路； 细胞凋亡

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，包括细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun蛋白氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)，调节细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应、凋亡等细胞生理、病理过程[1-3]。H2S由小肠胱硫醚 γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，CSE)催化L-半胱氨酸生成，对肠缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤起保护作用[4-5]，但机制未明确。本文建立大鼠肠缺血再灌注损伤模型，研究H2S对I/R损伤大鼠回肠上皮细胞凋亡、MAPKs表达的影响，结果报告如下。

材　料　和　方　法

1动物、试剂、仪器

健康雄性Wistar大鼠，SPF级，6周龄，体质量200～250 g，由浙江大学医学院动物中心提供，动物合格证号为201001018。

硫氢化钠(sodium hydrosulfide，NaHS)购自Sigma；羊抗大鼠p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65和p38MAPK的单克隆I抗、TUNEL检测试剂盒购自Santa Cruz；羊抗大鼠GAPDH单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG、DAB显示剂、SDS凝胶、ECL发光液、转膜液、硝酸纤维膜和Bradford蛋白试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司；ERK的上游引物序列为 5’-TCCTTGGGAGGGAAGATACC-3’，下游引物序列为 5’-ATGACAATCCCGTAGCTCCA-3’，扩增片段为100 bp；JNK的上游引物序列为5’-AGCCTTGTCCTTCGTGTC-3’，下游引物序列为5’-AAAGTGGTCAACAGAGCC-3’，扩增片段为330 bp；p38MAPK的上游引物序列为5’-AAGATGCTGGTTTTGGACTCG-3’，下游引物序列为5’-GTCAGGCTCTTCCATTCGTCT-3’，扩增片段为300 bp；β-actin的上游引物序列为5’-GAGGCCCAGAGCAAGAGAGG-3’，下游引物序列为5’-TCACCGGAGTCCATCACGAT-3’，扩增片段为600 bp。各基因引物由Invitrogen合成；TRIzol、RT-PCR试剂盒购自TaKaRa。

电泳仪(Bio-Rad)、敏感硫电极和PXS-270离子计购于上海雷磁仪器厂；图像分析软件(VILBER LOURMAT)。

2方法

2.1实验动物分组及肠缺血-再灌注损伤模型的建立按随机数字表法将30只雄性Wistar大鼠分为假手术(sham)组、I/R组、I/R+NaHS组，每组10只。腹腔注射20%乌拉坦(5 mL/kg体重)麻醉，经腹正中切口剖腹及游离肠系膜上动脉(superior mesenteric artery，SMA)，钳夹I/R组和 I/R+NaHS组大鼠的SMA缺血 60 min，松开再灌注120 min，建立大鼠肠I/R损伤模型[4-5]。I/R+NaHS组大鼠于灌注前10 min经尾静脉注入100 μmol/kg NaHS后按1 mg·kg-1·h-1输注直到再灌注2 h，向sham组和I/R组大鼠的尾静脉注入相同体积的生理盐水，作用时间和持续时间均同I/R+NaHS组[4-5]。实验结束后处死大鼠，取回肠末端标本在液氮中保存或甲醛中固定，取血离心分离血浆，-20 ℃保存。

2.2血浆及回肠匀浆中H2S浓度的测定末端回肠用DEPC清洗后行组织匀浆，采用敏感硫电极法完成H2S浓度测定，具体方法和步骤参照文献[4-6]。

2.3RT-PCR检测回肠组织ERK、JNK、p38MAPK的mRNA表达TRIzol一步法提取回肠黏膜总RNA，电泳见28 S、18 S条带，以2.5 μg总RNA为模板按照反转录试剂盒说明书反转录合成cDNA。再按PCR试剂盒说明书进行cDNA扩增。PCR条件为94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，ERK(53 ℃)/ JNK、p38MAPK(55℃)/β-actin(57 ℃) 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环;72 ℃ 7 min。各取7 μL PCR产物和3.5 μL DNA marker上样，各目的基因扩增产物和内参照β-actin扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，采用UVPGD800图像分析处理系统进行目的基因电泳条带密度分析，以ERK、JNK、p38MAPK mRNA与β-actin mRNA的比值表示ERK、JNK、p38MAPK mRNA的相对表达。

2.4Western blot 检测p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK蛋白的水平取回肠组织冰冻标本0.5 g于RIPA裂解液中碾磨，以Bardford法测定蛋白浓度。取50 μg蛋白行SDS-PAGE，转膜(0.65 mA/cm2)；室温封闭3 h，加入I 抗[按p-ERK抗体(1∶1 000)、p-JNK(1∶750)、p-p38MAPK(1∶500)、p-NF-κB P65(1∶300)、GAPDH抗体(1∶800)比例稀释]，4 ℃过夜。漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的IgG II抗室温反应1.5 h，0.1% TBST洗膜，ECL发光、压片、显影。使用BandScan分析胶片灰度值，以p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK与GAPDH灰度值比值表示p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK的相对蛋白含量。

2.5回肠组织TUNEL染色参照TUNEL检测试剂盒说明书步骤进行。末端回肠组织石蜡包埋切片经脱蜡、梯度乙醇脱水，蛋白酶K消化后，依次加入TUNEL反应混合液、Converter-POD。DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片。以不加TdT酶作为阴性对照，细胞核呈棕色着色的为阳性细胞。在高倍镜(×200)视野下随机取5个视野，计数细胞总数和凋亡细胞数。凋亡指数(apoptosis index，AI)=凋亡细胞数/细胞总数×100% ，以5个视野的均值代表每只大鼠回肠上皮细胞的凋亡率。

3统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用单因素方差分析，多样本均数间两两比较用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1血浆及回肠组织匀浆中H2S水平变化

I/R组血浆及回肠组织匀浆中H2S均低于sham组和I/R+NaHS组(P<0.01),见图1。

Figure 1.The content of H2S in the plasma and ileal homogenate.Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图1血浆和回肠组织匀浆中H2S浓度的变化

2回肠上皮细胞AI变化

TUNEL染色下sham组未见凋亡的细胞，I/R组和I/R+NaHS组均有棕色凋亡的回肠上皮细胞，I/R组多于I/R+NaHS组；I/R组的AI高于sham组和I/R+NaHS组(P<0.01),见图2。

Figure 2.The apoptosis of ileum epithelial cells in the rats with different treatments (TUNEL staining, ×200).Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图2各组大鼠回肠上皮细胞的 TUNEL染色观察

3回肠组织ERK、JNK、p-p38MAPK的mRNA水平

I/R组ERK mRNA低于sham组和I/R+NaHS组，JNK和p38MAPK mRNA高于sham组和I/R+NaHS组,见图3。

4回肠组织p-ERK、p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK的蛋白水平

I/R组的p-ERK低于sham组和I/R+NaHS组，p-JNK、p-NF-κB P65、p-p38MAPK均高于sham组和I/R+NaHS组,见图4。

讨　　论

I/R损伤时氧自由基和炎症因子等大量释放、呼吸爆发、ATP生成障碍、凋亡信号通路基因表达上调等导致小肠上皮细胞发生坏死或凋亡，表现为小肠黏膜屏障功能障碍[4, 7]。细胞凋亡是由基因调控的程序性细胞死亡[4, 7]。本研究发现TUNEL染色下I/R组回肠上皮细胞凋亡，AI显著高于sham组。因此肠I/R损伤大鼠回肠上皮细胞发生凋亡，与文献结果一致[4, 7]。本研究结果显示I/R组的H2S低于sham组，H2S与AI呈负相关，表明内源性H2S减轻肠I/R损伤大鼠回肠上皮细胞凋亡，与文献结果一致[4]。研究表明MAPK信号通路在损伤组织细胞凋亡中发挥重要作用[8-9]。丝裂原、生长因子、G蛋白偶联受体均可使Raf、Mos、Tpl2活化，依次激活MEK、ERK，介导细胞生长、分化、增殖[8]。应激、炎症介质、细胞因子、生长因子可使MLK3、TAK、DLK、MKK3、MKK6活化，激活p38MAPK；也可使MEKK1、MEKK4、MLK3、ASK1、MKK4、MKK7活化，激活SAPK、JNK，NF-κB，上调TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-12、iNOS、COX-2、黏附分子、集落刺激因子并下调锌指蛋白A20、血红素加氧酶-1表达，促进细胞凋亡并抑制细胞生长、分化[1-2, 9]。本研究结果发现与sham组比较，I/R组的ERK mRNA表达下调且磷酸化水平降低，与AI呈负相关；I/R组的JNK及p38MAPK mRNA表达上调,JNK,p38MAPK和NF-κB磷酸化水平升高，提示MAPK信号通路参与缺血再灌注损伤大鼠回肠上皮凋亡。

Figure 3.Hydrogen sulfide up-regulated the mRNA expression of ERK and down-regulated the mRNA expression of p38MAPK and JNK in the ileum epithelial cells of the rats. M：DNA marker. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图3各组大鼠回肠组织ERK、p38MAPK、JNK的mRNA表达

Figure 4.Hydrogen sulfide up-regulated p-ERK protein and down-regulated p-JNK, p-NF-κB P65, p-p38MAPK in the ileum of the rats.Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

图4大鼠回肠组织p-ERK、p-p38MAPK、p-JNK、p-NF-κB P65蛋白水平的变化

H2S是续一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3种气体信号分子，由CSE等催化L-半胱氨酸合成。H2S具有激活K+ATP 通道扩张血管、抑制白细胞-上皮细胞黏附、抗氧化、介导中性粒细胞凋亡，增加胃黏膜血流、抑制白细胞-上皮细胞黏附从而改善非类固醇抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs， NASIDs)引起的胃黏膜损伤等作用[10-11]。H2S能减轻 I/R损伤大鼠小肠黏膜屏障功能障碍[4-5]。本研究结果显示I/R+NaHS组AI低于I/R组，H2S高于I/R组，AI与H2S呈负相关。因此，H2S可抑制I/R损伤大鼠回肠上皮凋亡，对I/R损伤大鼠。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Role of hydrogen sulfide in ileal epithelial cell apoptosis by MAPK signaling pathway in rats with intestinal ischemia-reperfusion injury

LU Gen-lin1, WU Ai-bing2, WANG Hong-bin3

(1TheFirstDepartmentofGeneralSurgery,YiwuCentralHospital,Yiwu322000,China;2OncologyCenter,TheHospitalAffiliatedtoGuangdongMedicalCollege,Zhanjiang523808,China;3DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,TheHospitalAffiliatedtoQinghaiUniversity,Xining810001,China.E-mail:lugenlin007@163.com)

AIM: To investigate the effect of hydrogen sulfide (H2S) on the expression of MAPKs and ileal epithelial cell apoptosis in the rats with intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury. METHODS: Healthy female Wistar rats were randomly divided into sham operation group, I/R group, I/R+sodium hydrosulfide (NaHS) group . The animal model of intestinal ischemia reperfusion was established. Apoptosis index (AI) of ileal epithelial cell was measured by TUNEL assay. H2S was detected by sensitive sulfide electrode. The mRNA expression of ERK, JNK and p38MAPK was detected by RT-PCR. The protein levels of phosphorylation(p)-ERK, p-JNK, p-NF-κB P65 and p38MAPK were determined by Western blot.RESULTS: H2S, ERK mRNA and p-ERK in I/R group were significantly higher than those in I/R+NaHS group and sham group while JNK mRNA, p38MAPK mRNA, p-JNK, p-p38MAPK, p-NF-κB P65 and AI were predominantly higher than those in I/R+NaHS group and sham group (P<0.01).CONCLUSION: H2S attenuates ileal epithelial cell apoptosis in the rats with intestinal I/R injury by down-regulating ERK mRNA p-ERk and up-regulating JNK mRNA, p38MAPK mRNA and phosphorylation of JNK, p38MAPK and NF-κB P65.

Ischemia-reperfusion injury; Hydrogen sulfide; MAPK signaling pathway; Apoptosis

1000- 4718(2016)04- 0691- 05

2015- 11- 17

2016- 02- 22

国家自然科学基金青年科学基金资助项目(No. 81201672)；义乌市人才引进立项项目(No. 2012-R-04)

Tel: 0570-7368680; E-mail: lugenlin007@163.com

R363; R656.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.018

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