张　弢，　王彦伟，　杨　杰，　袁方正圆，　张继航，　黄　岚

(第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所，重庆 400037)



抑制囊泡转运对大鼠内皮祖细胞增殖及钙库操纵性钙内流的影响*

张弢，王彦伟，杨杰，袁方正圆，张继航，黄岚△

(第三军医大学新桥医院全军心血管病研究所，重庆 400037)

目的： 研究囊泡转运在大鼠内皮祖细胞(EPCs)增殖及钙库操纵性钙内流(SOCE)调控中的作用。方法: 密度梯度离心法分离获取、并用acLDL-DiI和FITC-UEA-I荧光双染鉴定脾源性EPCs。布雷菲德菌素A(BFA)抑制囊泡转运，CCK-8法和实时无标记细胞功能分析仪观察EPCs增殖变化，流式细胞术检测凋亡情况，并检测囊泡转运关键蛋白ADP核糖基化因子GTP酶活化蛋白1(ARFGAP1)的表达。激光共聚焦显微镜观察囊泡转运抑制后SOCE并用Western blot 检测SOCC复合体蛋白表达，进一步采用RNA干扰的方式观察囊泡转运对瞬时受体电位通道1(TRPC1)蛋白表达及SOCE的影响。结果: 双染鉴定大鼠脾源性EPCs阳性率为82.53%±6.12%。BFA显著抑制EPCs的增殖但对凋亡无明显影响，同时ARFGAP1表达也明显降低，说明EPCs的囊泡转运受到抑制。抑制EPCs囊泡转运显著下调TRPC1的表达，并降低SOCE。siTRPC1使EPCs的SOCE下降，但si-TRPC1预处理并抑制囊泡转运并没有使EPCs的SOCE进一步降低。结论: 抑制EPCs的囊泡转运可以抑制EPCs的增殖并通过下调TRPC1的表达降低SOCE水平。

内皮祖细胞； 囊泡转运； 瞬时受体电位通道1

血管内皮损伤是动脉粥样硬化发生的病理基础，血管损伤后，邻近的内皮细胞对损伤的血管内皮进行有限的修复。既往研究证实，内皮损伤后内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)——内皮细胞的前体细胞——通过动员到外周血，归巢至损伤血管处，参与受损内皮的修复。因此，研究内皮祖细胞增殖的相关机制显得尤为重要。

本实验室早先的研究发现钙库操纵性钙通道(store-operated Ca2+channels，SOCC)通过调控钙库操纵性钙内流(store-operated calcium entry，SOCE)影响EPCs的增殖等生物学功能[1]。间质相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)作为SOCC的钙离子感受器，感受内质网钙库钙离子浓度变化，当钙库耗竭时通过与细胞膜上钙释放激活钙调因子1(calcium release-activated calcium modulator 1，Orai1)和/或瞬时受体电位通道1(transient receptor potential channel 1，TRPC1)相互作用，从而激活SOCE。Orai1和TRPC1是细胞膜上的通道蛋白，SOCC的重要组成部分。Orai1、TRPC1和STIM1对EPCs的SOCE起重要调节作用[2-3]。囊泡转运作为部分膜蛋白的重要运输方式[4]可能会影响Orai1和TRPC1的表达与转运，进一步调控SOCE。ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)是囊泡转运的关键成分，调控囊泡的生成。ARF只有和GTP结合时才具有活性。ARF主要参与蛋白质在内质网和高尔基体之间的转运，对蛋白的分拣起到启动作用。本课题使用布雷菲德菌素A(brefeldin A，BFA)抑制细胞内部ARF的活性，阻断ARF与GTP的结合，从而特异性地抑制细胞内囊泡转运。囊泡转运受抑制后，细胞增殖减弱，因此，细胞的增殖功能也常被用作评价囊泡转运抑制效率的重要参考。囊泡转运与调节TRPC1的膜表达密切相关[5]，但其对SOCE及SOCC其它组成蛋白是否有影响尚未见报道。我们拟使用BFA抑制大鼠EPCs的囊泡转运观察其对SOCC复合体组成蛋白表达和SOCE的影响，这将有助于找到全新的SOCC复合体调节靶点，提高EPCs的血管修复能力，为血管损伤修复提供新的研究方向。

材　料　和　方　法

1动物

成年雄性SD大鼠，重约150 g，SPF级，购自新桥医院实验动物中心。

2主要试剂

BFA购自Selleck；DMEM低糖培养基和胎牛血清购自Gibco；大鼠淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司；蛋白裂解液、CCK-8试剂和Fluo-3/AM购自碧云天生物公司；STIM1和ARF GTP酶活化蛋白1(ARF GTPase-activating protein 1, ARFGAP1)抗体购自CST；TRPC1-siRNA和Orai1抗体购自Santa Cruz；TRPC1抗体购自Abcam；LipofectamineTM2000由Invitrogen生产。

3主要方法

3.1脾源性大鼠EPCs的培养与鉴定参照本实验室前期工作方法[1]，颈部脱臼法处死大鼠，无菌条件下取脾脏分离单个核细胞培养5～7 d。用acLDL-DiI和FITC-UEA-I荧光双染鉴定EPCs。

3.2实时无标记细胞功能分析仪(real-time cell analyzer instrument，RTCA)测定BFA对EPCs增殖能力的影响原代EPCs以每孔5×104个细胞密度接种至E-Plate L8，对照组和BFA组各设3个复孔。上样后将E-Plate L8放到iCelligence系统上，系统会自动扫描记录细胞生长全程。37 ℃、5% CO2培养48 h，换新鲜培养基并向BFA组中加入BFA(1 μmol/L)，继续培养至120 h。数据导入RTCAData Analysis Software 1.0进行分析。

3.3CCK-8法测定BFA对EPCs增殖能力的影响根据说明书，将原代EPCs以每孔5 000个的密度接种至96孔板，每组4个复孔。设置不同浓度BFA组(0.01、0.1、0.5、1、10、100 μmol/L)，37 ℃、5% CO2培养24 h，弃原培养基，每孔加100 μL不含血清DMEM培养基和10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h后酶标仪测定450 nm波长的吸光度，重复3次。

3.4流式细胞术检测凋亡率预处理好EPCs，收集各组细胞上清液，PBS洗涤并用胰酶消化贴壁细胞3 min，终止消化后与先前收集的对应组上清液细胞混合，PBS洗涤3次制备1×106的细胞悬液，加Anne-xin V和PI染色，上流式细胞仪检测凋亡率。

3.5细胞内钙离子浓度的测定共聚焦培养皿上接种原代EPCs，培养至细胞融合率超过80%，加5 nmol/L的Fluo-3/AM，37 ℃避光孵育30 min。换新鲜DMEM培养基继续孵育40 min，无钙PBS洗涤3次加1 mL无钙PBS，激光共聚焦显微镜下观察(激发波长488 nm，发射波长530 nm)细胞的荧光强度。

3.6蛋白印迹实验细胞裂解液处理EPCs提取总蛋白，BCA法测量蛋白浓度。10% SDS-PAGE分离蛋白，50 μg蛋白上样量，120 V恒压电泳至目的蛋白与其它蛋白明显分离，后以90 V、90 min将分离胶上蛋白电转至PVDF膜。电转后5%的脱脂奶粉封闭，4 ℃条件下I抗孵育过夜，TBST洗涤3次，加II抗37 ℃孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL显色。

3.7TRPC1-siRNA转染EPCs6孔板培养EPCs至细胞融合率达到70%以上，换成无青霉素和链霉素的含20%胎牛血清的DMEM低糖培养基继续培养24 h。250 μL转染培养基稀释4 μg TRPC1-siRNA，另外250 μL转染培养基稀释5 μL LipofectamineTM2000，后将两者混合，于室温下静置20 min。再将500 μL混合液加入6孔板单孔，37 ℃、5% CO2培养6 h后换成2 mL的含血清DMEM低糖培养基继续培养48 h。最后通过Western blot检测转染效率。

4统计学处理

使用SPSS 19.0软件进行分析，数据表示为均数±标准差(mean±SD),多组间比较使用单因素方差分析，两组之间比较使用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1BFA对EPCs增殖的影响

BFA是囊泡转运的特异性抑制剂，为了探索BFA合适的作用浓度，我们用0.1～100 μmol/L不同浓度BFA处理EPCs并观察对增殖的影响。如图1所示，BFA浓度为1 μmol/L时细胞增殖明显受到抑制。为了进一步探索合适的BFA作用时间，我们用1 μmol/L BFA处理细胞后利用RTCA技术动态观察细胞增殖情况，发现24 h 时BFA处理组与对照组比较差异有统计学显著性(P<0.05)。考虑到药物对细胞的其它影响，我们选择把浓度为1 μmol/L 的BFA处理24 h作为后续实验的处理条件。

Figure 1.BFA inhibited the proliferation of EPCs detected by CCK-8 assay after the cells were exposed to different concentrations of BFA (A), and the proliferation of the cells at different time points after treated with BFA (1 μmol/L) was detected (B). Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

图1BFA抑制EPCs增殖

2BFA对EPCs凋亡的影响

如图2所示，对照组的凋亡率为8.73%±0.63%，BFA处理组的凋亡率为9.67%±0.29%，2组间差异无统计学显著性，从而说明EPCs增殖降低不是因为凋亡引起。

3BFA对ARFGAP1蛋白表达的影响

我们用浓度为1 μmol/L 和0.1 μmol/L的BFA分别 处理EPCs，观察ARFGAP1的表达变化，结果显示，1 μmol/L处理组的 ARFGAP1表达明显低于对照组(P<0.05)，见图3。

Figure 2.BFA had no influence on the apoptosis of EPCs. Apoptosis was detected by flow cytometry after treatment with BFA (1 μmol/L). Mean±SD.n=3.

图2BFA对EPCs凋亡无影响

Figure 3.BFA down-regulated the expression of ARFGAP1. EPCs were treated with various concentrations (0.1 and 1 μmol/L) of BFA. The expression of ARFGAP1 was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

图3BFA下调ARFGAP1表达

4抑制囊泡转运对SOCE以及细胞内钙浓度的影响

如图4所示，BFA处理组所激发的SOCE波峰明显低于对照组，细胞内游离钙离子浓度同样明显低于对照组(P<0.05)。

Figure 4.Vesicular transport inhibition reduced SOCE and concentration of intracellular calcium. EPCs, incubated with or without BFA (1 μmol/L) for 24 h, were treated with thapsigargin (TG; 2 μmol/L) to induce the release of intracellular calcium store in a calcium-free solution (left peak of A), followed by Ca2+(2 mmol/L)to induce calcium [Ca2+] inward (right peak of A). At the same time, the average value of intracellular calcium ([Ca2+]i) was detected (B). Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

图4抑制囊泡转运降低SOCE和细胞内钙浓度

5抑制囊泡转运对SOCC主要组成蛋白表达的影响

TRPC1、Orai1和STIM1是SOCC复合体的主要组成分子，其表达的改变能够明显影响SOCE。我们研究发现抑制囊泡转运会下调TRPC1的表达，但对Orai1和STIM1的表达无明显抑制，见图5。

Figure 5.Vesicular transport inhibition down-regulated the expression of TRPC1. The EPCs were treated with BFA (1 μmol/L), and then the main proteins of SOCC complex were detected. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

图5抑制囊泡转运下调TRPC1表达

6TRPC1-siRNA转染EPCs后对钙流的影响

TRPC1-siRNA转染后，TRPC1表达明显受到抑制(P<0.01)，而后我们检测抑制TRPC1对EPCs的SOCE水平的影响，发现其明显低于对照组，进一步在抑制TRPC1的基础上同时抑制囊泡转运，SOCE的水平与单独抑制TRPC1无明显差异。我们还观察了有钙环境下EPCs的钙内流水平变化情况，发现单独抑制TRPC1和抑制囊泡转运都会降低钙内流水平，而同时抑制TRPC1和囊泡转运钙内流水平与单独抑制TRPC1无明显差异。这说明了抑制囊泡转运引起的SOCE降低与TRPC1相关，见图6。

Figure 6.Vesicular transport inhibition decreased the levels of SOCE in the EPCs via regulation of TRPC1. The expression of TRPC1 was detected by Western blot after transfection with siTRPC1 (A). EPCs were treated with TG (2 μmol/L) to induce the release of intracellular calcium-store in a calcium-free solution (left peak of B), followed by Ca2+to induce calcium inward (right peak of B). Meanwhile, the calcium current was detected after EPCs were treated with Ca2+(C). Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

图6抑制囊泡转运通过调控TRPC1减弱EPCs的SOCE

讨　　论

既往研究发现，囊泡转运是细胞的基本生理过程之一，调控着细胞内多种物质的转运，囊泡转运受到抑制时细胞增殖会相应地下降。我们用囊泡转运抑制剂BFA处理EPCs发现增殖受到明显抑制，推测囊泡转运可能受到抑制，但有文献报道BFA还可以诱导内质网应激引起凋亡[6]，因此我们观察了BFA对EPCs凋亡的影响，结果显示BFA处理对EPCs凋亡无明显影响，说明EPCs增殖的抑制主要由囊泡转运的抑制引起。与此同时我们检测了囊泡转运相关蛋白ARFGAP1的表达情况，它的主要作用是调节囊泡形成以及膜转运过程，其表达水平的变化可以间接反映胞内囊泡转运情况[7]，进一步证实了 EPCs的增殖抑制主要由囊泡转运受到抑制引起。

我们的研究发现，抑制大鼠EPCs的囊泡转运， EPCs的钙释放激活通道电流和细胞内钙浓度均明显降低，说明抑制囊泡转运降低SOCE。为了探索SOCE降低的相关机制，我们观察了BFA对SOCC复合体主要组成蛋白(Orai1、STIM1和TRPC1)表达的影响，结果显示TRPC1表达明显下调，而Orai1和STIM1表达无明显变化，故我们推测抑制囊泡转运对SOCE的影响可能与TRPC1有关。继而我们利用基因技术干扰TRPC1表达并观察BFA对SOCE的影响，结果显示与siTRPC1组相比，干扰TRPC1后加BFA处理SOCE无明显变化，说明抑制囊泡转运通过下调TRPC1表达，进而导致SOCE的降低。我们的发现首次阐明了囊泡转运与SOCE之间的关系，并对相关机制进行了初步探索。

我们的研究主要通过BFA抑制ARF分子来实现对囊泡转运的调控。ARF广泛存在于真核细胞中，对于膜转运具有关键性的调节作用[7]。它主要作用于囊泡的形成起始阶段，通过调控招募囊泡的生物合成蛋白以及修饰跨膜蛋白来实现此功能。ARF与其它调节型GTP结合蛋白一样，在GTP和GDP的循环之间起到分子开关的作用[8]，当ARF与GTP结合时才具有活性，而这种活性状态能够被BFA所阻断[9]。研究表明BFA可以竞争性抑制ARF与GTP的结合从而导致囊泡前体COPI受阻，使蛋白质在内质网中堆积，不能正常转运到高尔基体[10]，通过此方式运输的膜蛋白也无法正常转运到细胞膜上进一步发挥生物学功能。

TRPC通道蛋白受囊泡转运相关蛋白的调控，从而影响其在细胞膜上的定位和功能发挥。有文献报道，正常细胞内异源性表达TRPC1对SOCE无明显影响[11]，而抑制正常细胞内的TRPC1蛋白表达则会明显降低SOCE[12]，这可能说明TRPC1只有转运到细胞膜上才能发挥功能。最近的研究还发现TRPC1只有转运到细胞膜上并且正确锚定到功能位点与辅助蛋白结合才能形成有功能的通道，囊泡转运在这一过程发挥了重要作用[13-14]。我们的研究发现，在EPCs上抑制囊泡转运，能够明显降低TRPC1的表达，进而降低SOCE， EPCs的增殖也同时受到了抑制。本实验室前期研究已经证明了通过下调SOCE可以降低EPC的增殖，但是抑制囊泡转运是否是通过调节SOCE来影响EPCs的增殖目前还不清楚，因而我们将在下一阶段的实验来进行验证。

本研究发现抑制EPCs的囊泡转运可以抑制EPCs的增殖并通过下调TRPC1的表达影响SOCC复合体的功能从而降低SOCE的水平。这说明囊泡转运可以作为SOCC复合体的一种全新的调控靶点从而影响EPCs生物学功能。在未来的研究中我们可以对TRPC1蛋白囊泡转运过程的进一步探索来实现对TRPC1功能的调控，从而为临床心血管疾病的治疗提供全新的分子靶标。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Influences of vesicular transport inhibition on proliferation and store-operated calcium entry in rat endothelial progenitor cells

ZHANG Tao, WANG Yan-wei, YANG Jie, YUAN Fang-zheng-yuan, ZHANG Ji-hang, HUANG Lan

(InstituteofCardiovascularDiseasesofPLA,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China.E-mail:huanglan260@126.com)

AIM: To investigate the effects of vesicular transport inhibition on the proliferation and regulation of store-operated calcium entry (SOCE) in rat endothelial progenitor cells (EPCs). METHODS: EPCs were isolated from the rats with density-gradient centrifugation and confirmed via double fluorescence staining with acLDL-DiI and FITC-UEA-I. After inhibition of vesicular transport with brefeldin A (BFA), the proliferation of EPCs was measured by CCK-8 assay and real-time cell analyzer instrument, apoptosis was analyzed by flow cytometry, and the expression of ADP-ribosylation factor GTPase-activating protein 1 (ARFGAP1), a key protein to vesicular transport, was also detected. SOCE was observed under laser scanning confocal microscope after the vesicular transport was inhibited, and the protein expression of SOCC complex was determined by Western blot. Furthermore, the influences of vesicular transport inhibition on the expression of transient receptor potential channel 1 (TRPC1) and SOCE were examined with a RNA interference method. RESULTS: The acLDL-DiI and FITC-UEA-I double positive rate of the cells was 82.53%±6.12%. BFA insult significantly inhibited the proliferation of EPCs and down-regulated the expression of ARFGAP1, and no influence on the apoptosis of the EPCs was observed, suggesting that vesicular transport of EPCs was inhibited. Vesicular transport inhibition remarkably down-regulated the expression of TRPC1 and decreased SOCE level. No evident difference in the level of SOCE between siTRPC1 group and siTRPC1+BFA group, in which the cells were pretreated with siTRPC1 before BFA addition, was observed. CONCLUSION: Vesicular transport inhibition in EPCs reduces the proliferation of EPCs and decreases SOCE level through down-regulation of TRPC1.

Endothelial progenitor cells; Vesicular transport; Transient receptor potential channel 1

1000- 4718(2016)04- 0591- 06

2015- 12- 31

2016- 03- 07

国家自然科学基金资助项目(No. 81370211)

Tel: 023-68755601; E-mail: huanglan260@126.com

R329.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.04.003

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