陈柳军，余钧池，黄萍，钟祥海，刘鑫

柳州市疾病预防控制中心，广西柳州545007



柳州市16例吸毒者HIV-1病毒流行株亚型分布及耐药情况分析

陈柳军，余钧池，黄萍，钟祥海，刘鑫

柳州市疾病预防控制中心，广西柳州545007

目的了解2011—2013年柳州市吸毒人群人类免疫缺陷病毒1（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）亚型分布和毒株耐药情况。方法从2011—2013年柳州市吸毒人群HIV-1感染者中，随机抽取16例作为研究对象，从血浆中抽提核酸RNA，用RT-PCR进行gag及pol基因扩增，并对扩增产物进行测序和序列分析。结果16例标本中存在2种HIV-1亚型：重组亚型CRF01_AE 14例（87.5%），重组亚型CRF07_BC 2例（12.5%）。6株发生相关耐药突变，主要发生在NRTIs和NNRTIs相关突变。结论2011～2013年柳州市吸毒人群HIV-1感染主要以CRF01_AE为主，主要在NRTIs和NNRTIs相关耐药突变。

HIV-1；吸毒人群；基因亚型；耐药

获得性人类免疫缺陷综合症简称艾滋病，是由人类免疫缺陷病毒（human Immunodeficiency virus，HIV）引起的一种慢性传染病。HIV在我国的流行始于1985年，经过散发期、蔓延期后，于1995年进入了快速增长期，HIV感染在全国范围内急剧上升，如不采取有效的控制措施，今后将会有更多的HIV感染者。中国自1996年在静脉吸毒人群（IDU）中发现首例本土HIV感染者以来，感染人数逐年上升。而柳州市是艾滋病疫情严重的地区之一，感染方式主要以性传播、静脉吸毒为主。了解近几年柳州市吸毒者HIV-1病毒流行株亚型分布及耐药情况，对于防控柳州市艾滋病的传播、治疗有重大意义。

1　材料与方法

1.1标本来源

从2011—2013年柳州市吸毒人群HIV感染者中，随机抽取16例。所有研究对象均经免疫印迹实验（WB）确认为HIV-1阳性。

1.2主要试剂

病毒DNA/RNA提取试剂盒购自西安天隆公司、核酸扩增试剂盒PrimeScript one step RT-PCR、Premix TaqTM、LA TaqTM Version 2.0 plus dye和普通琼脂糖购自大连宝生物TaKaRa。

1.3核酸提取、扩增及测序

使用病毒DNA/RNA提取试剂盒从200 μL保存好的血浆中提取HIV RNA，采用巢式PCR方法扩增HIV-1 gag、pol基因片段，扩增引物如表1所示。巢式PCR第一步扩增使用PrimeScript one step RT-PCR试剂盒，第二步扩增采用Premix TaqTM LA TaqTM Version 2.0 plus dye试剂盒。第二步扩增产物经琼脂糖电泳验证后，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

表1　扩增gag、pol基因片段的反应引物

1.4亚型分析

用Chromas查看测序所得序列，Vector NTI Suite 10的Contig Express进行序列拼接，ClustalX2进行序列比对，经BioEdit序列比对、修饰后，用MEGA 5软件的Neighbor-Joining法构建系统进化树，所得进化树用Bootstrap法检验（重复500次），根据序列与参考序列的聚集情况确定病毒亚型，参考序列均来自Los Alamos National Laboratory HIV database（http：//www.hiv.lanl.gov/）。

1.5耐药性分析

将测序所得pol基因序列提交至美国斯坦福大学HIV耐药性数据库（Stanford University HIV Drug Resista nce Database，http：//hivdb.stanford.edu/），点击进入HIV db PROGRA，输入已测序列即可获得各序列的耐药位点及相关耐药信息。

2　结果

2.1基因分型

16份样本成功扩增测序得到14条gag和11条pol基因片段，将基因序列输入到HIV BLAST中，发现CRF01_AE 14例，占87.5%（14/16），CRF07_BC 2例，占12.5%（2/16）。将gag基因片段序列与典型高频参考序列进行比对，应用MEGA 5软件构建系统进化树，见图1，图中实心圆圈“●”代表典型的高频出现的共享序列，黑色实心三角“▲”代表测序后的基因片段。从系统进化树可以看出，重组亚型CRF01_AE高频参考序列出现的城市主要来自广西、福建、江苏、辽宁、四川，重组亚型CRF07_BC对应的高频参考序列出现的城市主要有广西、北京、新疆。

2.2耐药分析

在获得的基因序列中，有6株产生耐药相关突变，见表1。蛋白酶抑制剂（PIs）相关突变有一种，为L10V；核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）相关突变有7种，分别为T69N、V75C、A62V、F116Y、Q151M、M184V和K65R；非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs）相关突变有五种，分别为Y181C、K101H、G190A、L100I和K103N。耐药性分析发现，PIs相关突变为潜在低度耐药，不会引起病毒对药物敏感性的改变；在NRTIs相关突变中，Q151M突变或M184V突变可引起毒株对拉米夫定（3TC）和恩去他滨（FTC）产生高度耐药，K65R突变可引起毒株对替诺福韦（TDF）、双脱氧肌苷（ddI）、阿巴卡韦（ABC）和司他夫定（d4T）产生中度或高度耐药；在NNRTIs相关突变中，K103N突变可引起毒株对奈韦拉平（NVP）产生高度耐药，G190A突变可引起毒株对NVP产生高度耐药及对依非韦仑（EFV）中度耐药。见表2。值得引起注意的是，在11例患者中，有2例患者出现了NRTIs，NNRTIs双突变。

表2　HIV-1流行株耐药相关突变位点及种类

图1　基于gag基因片段序列构建的进化树

3　讨论

该研究对柳州市16例吸毒者HIV-1病毒流行株进行基因亚型分析，发现柳州市吸毒人群HIV-1亚型主要以重组亚型CRF01_AE为主，其次为重组亚型CRF07_BC，没有发现重组亚型CRF08_BC，这与广西HIV分子流行病学调查结论一致［1］。其中，CRF01_AE与广西、福建、江苏、辽宁、四川流行株的相似性较高，CRF07_BC与广西，北京。新疆流行株的相似性较高。在上世纪90年代，中国首次在云南和广西确认CRF01_AE重组型毒株，随后在性传播和吸毒高危人群中传播［2-3］，在2006年的全国HIV分子流行病学调查中发现，CRF01_AE重组型毒株已迅速成为我国最广泛流行的毒株［4-5］，至今在各个感染途径中，仍占主要位置。由于柳州市吸毒人群HIV-1亚型没有发现CRF08_BC，而广西全省流行的HIV-1亚型存在有CRF01_AE、CRF07_BC、 CRF08_BC、CRF55_01B和B型，因此对柳州市吸毒人群的HIV防治工作，应制定符合本地方特色的策略，方能更好地控制HIV的蔓延。

从该次耐药研究中发现，吸毒人群HIV-1感染者经过抗病毒治疗后已有部分感染者产生耐药，PIs相关突变为潜在低度耐药，不会引起病毒对药物敏感性的改变；NRTIs相关突变存在着Q151M突变、M184V突变及K65R突变，该突变可引起HIV-1毒株对3TC、FTC、TDF、ddI、ABC和d4T产生中度或高度耐药；NNRTIs相关突变存在着K103N突变和G190A突变，该突变可引起毒株对NVP和EFV产生中度或高度耐药。随着柳州市抗病毒治疗人群的增加，治疗人群的耐药情况也会越发严重，并可能发生扩散，这对柳州市艾滋病防控、治疗提出了严峻考验。由于该次研究样本量较少，而对于HIV-1流行株耐药情况分析，需进行连续动态监测，方能及时发现新的耐药情况。因此，今后需加强该方面的监测工作，为柳州市HIV-1抗病毒治疗和防止耐药株传播提供技术支持。

［1］苏齐鉴，周平，闭志友，等.柳州和南宁市HIV-1亚型分布及耐药情况调查［J］.病毒学报，2010，7（4）：290-294.

［2］Liao H，Tee KK，Hase S，et al.Phylodynamic analysis of the dissemination of HIV-1 CRF01_AE in Vietnam［J］.Virology，2009，391（1）：51-56.

［3］Yu XF，Chen J，Shao Y，et al.Two subtypes of HIV-1 among injection-drug users in southern China［J］.Lancet，1998，351（9111）：1250.

［4］Zhao B，Han X，Dai D，et al.New trends of primary drug resistance among HIV type 1-infected men who have sex with men in Liaoning Province，China［J］.AIDS Res Hum Retroviruses，2011，27（10）：1047-1053.

［5］Zhang X，Li S，Li X，et al.Characterization of HIV-1 subtypes and viral antiretroviral drug resistance in men who have sex with men in Beijing，China［J］.AIDS，2007，21（Suppl 8）：S59-S65.

Analysis of HIV-1 Virus Epidemic Strain Subtype Distribution in 16 Cases of Drug Users in Liuzhou and Drug Resistance

CHEN Liu-jun，YU Jun-chi，HUANG Ping，ZHONG Xiang-hai，LIU Xin
Center for Disease Prevention and Control，Liuzhou，Guangxi Province，545007 China

Objective To know the HIV-1 virus epidemic strain subtype distribution in drug users in Liuzhou from 2011 to 2013 and drug resistance.Methods 16 cases of HIV-1 infected persons in the drug users in Liuzhou from 2011 to 2013 were randomly selected as the research objects，and the nucleic acid RNA was extracted from blood plasma，RT-PCR was used for gag and pol gene amplification，and the amplification products were given sequencing and sequential analysis.Results In the 16 cases of specimens，there were 2 HIV-1 subtypes，14 cases of reconstruction subtypes CRF01_AE（87.5%），and 2 cases of reconstruction subtypes CRF07_BC（12.5%），the related drug resistance mutation occurred to 6 strains，and NRTIs and NNRTIs related mutations were the main.Conclusion The HIV-1 infection of drug users in Liuzhou from 2011 to 2013 was mostly CRF01_AE，and the NRTIs and NNRTIs related mutations were the main.

HIV-1；Drug user；Gene subtype；Drug resistance

R52

A

1672-5654（2016）09（a）-0081-03

10.16659/j.cnki.1672-5654.2016.25.081

2016-05-25）

［课题资助］广西科学技术厅立项课题（项目编号：桂科攻1140003A-44）；广西卫生厅资助课题（项目编号：Z2007289）。

陈柳军（1966.11-），男，广西柳州人，本科，副主任检验技师，研究方向：病原微生物检测。