许瑞雪，刘晓兰，王俊彤，郑喜群（齐齐哈尔大学食品与生物工程学院/农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

体外消化对玉米谷蛋白酶解物抗氧化活性的影响

许瑞雪，刘晓兰*，王俊彤，郑喜群
（齐齐哈尔大学食品与生物工程学院/农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

以玉米蛋白粉为原料提取玉米谷蛋白，利用蛋白酶对其进行酶解，制备蛋白水解物，再用胃蛋白酶及胰蛋白酶对其进一步消化处理，以抗氧化活性为指标对消化过程中蛋白酶加量进行优化，制备富含谷氨酰胺的具有抗氧化功能的蛋白水解物。结果表明，玉米谷蛋白经复合蛋白酶水解后，蛋白收率（54.41±3.26）%，水解物的羟基自由基清除率、亚铁离子螯合能力及还原力分别达到（29.50±0.31）%、（73.33±0.62）%及0.50±0.01；二步消化后蛋白水解物羟基自由基清除率、亚铁离子螯合能力及还原力分别达到（55.88±0.94）%、（90.44±0.01）%及0.40±0.01。

玉米谷蛋白；消化；胃蛋白酶；胰蛋白酶

玉米是世界上的三大粮食作物之一，2014年～2015年我国玉米产量为2.155亿t（国际谷物理事会（IGC）发布），位居世界第二位［1］。随着玉米产量的逐年增加，玉米深加工的领域也得到不断的扩展。玉米蛋白粉，又称玉米黄粉，是玉米湿法生产淀粉过程中的副产物，其中含62%～71%的蛋白质，主要组分为玉米醇溶蛋白（65%～68%）和谷蛋白（22%～23%）还有少量的球蛋白（1.2%）和白蛋白［2］。

Gln可以有效的改善人体酸碱平衡，改善胃肠道功能，提高机体免疫力［3］，还可以增强机体抗氧化能力，或是直接抑制自由基的产生［4］，具有重要的免疫调节作用。但直接将Gln应用于食品或医药中非常困难，因为其自身溶解度低且不稳定［5］。玉米谷蛋白含大量门冬酰胺和谷氨酰胺（Gln）氨基酸，其中谷氨酰胺含量约占总氨基酸的1/3［5］。用蛋白酶将玉米谷蛋白水解后，生成的蛋白水解物中含大量谷氨酰胺肽，含谷氨酰胺肽在胃和小肠内经消化易分解出谷氨酰胺。

统计数据表明，我国不同地区有7%～41%的人口具有功能性消化不良症状［6］，针对这类人群，将富含谷氨酰胺的蛋白质水解物进行体外消化，制备具有改善胃肠道功能的抗氧化功能性食品基料具有必要性。本文利用复合蛋白酶先对玉米谷蛋白进行酶解，然后利用胃蛋白酶、胰蛋白酶模拟体内消化处理，顺序水解玉米谷蛋白水解物，对胃蛋白酶、胰蛋白酶的加酶量进行优化，制备富含谷氨酰胺的具有抗氧化活性的蛋白水解物，为其在食品工业的应用提供参考。

1　材料与方法

1.1试验材料

玉米黄粉：购自黑龙江省龙凤玉米开发有限公司；复合蛋白酶（1.5 AU/g）：购自丹麦NovoNordisk公司；胃蛋白酶（1∶3 000）、胰蛋白酶（1∶2 500）：购自生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

1.2玉米谷蛋白的制备

挤压膨化：参考郑喜群报道的方法［7］。将玉米黄粉含水量调节为16%，放置过夜后，在160℃～180℃和1 MPa条件下，利用双螺杆膨化机进行玉米黄粉的膨化，膨化后的样品粉碎后备用。

去除淀粉：用pH6.5的PBS缓冲液配制浓度为10%的膨化玉米黄粉悬浮液，加入α-淀粉酶（30 U/g）于悬浮液中，在pH6.5和60℃条件下反应2 h。取出悬浮液于3 000 r/min离心20 min，取沉淀，用与PBS缓冲液等量的水洗涤滤饼3次。

去除醇溶蛋白：将去除淀粉后的玉米黄粉用70%乙醇60℃萃取2 h，料液比为1∶10（g/mL），取出悬浮液于3 000 r/min离心20 min（重复2次），取沉淀晾干后即得到粗的玉米谷蛋白。

玉米谷蛋白的提取纯化（碱提酸沉法）：用0.1 mol/L NaOH进行提取，料液比为1∶10（g/mL），60℃水浴震荡2 h，取出悬浮液于3 000 r/min离心20 min，取上清液（重复以上方法，继续反应1 h），将两次离心得到的上清液，用4 mol/L HCl调pH至4.8（谷蛋白等电点），混合液于3 000 r/min条件下离心20 min，将沉淀用70%乙醇溶液洗涤两遍，用蒸馏水洗涤两遍，所得滤饼冷冻干燥即可。

1.3玉米谷蛋白的酶解

以玉米谷蛋白为底物，溶于0.02 mol/L pH7.0的PBS缓冲液中（底物浓度为5%），利用复合蛋白酶酶解［（加酶量0.81%（质量分数）］，在50℃条件下反应2 h，反应结束后将水解物置于沸水浴中5 min灭酶，将样液于3 000 r/min条件下离心20 min后，取上清液冷冻干燥，备用。

1.4玉米谷蛋白水解物的消化

一步消化：取酶解后的蛋白水解物，加入不同含量的胃蛋白酶，于37℃、pH2.0条件下反应2 h，试验结束后将水解物置于沸水浴中灭酶5 min，对冷却后的水解物进行离心取上清液调pH至7.0后冷冻干燥，对产物进行抗氧化活性分析。

二步消化：取酶解后的水解物，按照已优化的加酶量向其中加入胃蛋白酶，于37℃、pH2.0条件下反应2 h后，加入不同含量的胰蛋白酶，于37℃、pH8.0条件下继续反应2 h，反应结束后将水解物置于沸水浴灭酶5 min，将水解物离心后取上清液冷冻干燥，对二步消化产物进行抗氧化活性分析。

1.5水解物各性能指标的测定

玉米谷蛋白总氮含量的测定采用凯氏定氮法［8］，样品中可溶蛋白含量的测定采用Folin-酚法［9］，样品水解度的测定采用pH-滴定法［10］，水解物分子量分布采用凝胶层析法［7］，溶解性的测定参考王俊彤报道的方法［11］。

样品蛋白回收率（PR）/%=（水解后蛋白含量/原料蛋白含量）×100。

1.6羟基自由基清除率的测定

参考王晓杰报道的方法，有改动［12］。采用固定反应体系，在试管中依次加入0.5 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，2.0 mL样品溶液，0.5 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液，6.5 mL水，以及0.5 mL、8.8 mmol/L的H2O2溶液，混合液于37℃水浴30 min，反应结束后在510 nm处测量样品的吸光值A1；取0.25 mL蒸馏水代替FeSO4溶液所测得的吸光值为A2，取2.0 mL蒸馏水代替样品溶液所测得吸光值为A3，样品对·OH的清除率Y/%= ［1-（A1-A2）/A3］×100。

1.7亚铁离子螯合能力的测定

参考Kong等方法，有改动［13］。取1 mL的蛋白水解物溶液加入试管中，加入0.05 mL 2 mmol/L FeSO4溶液，混匀后加入1.85 mL双蒸水，然后加入0.1 mL 5 mmol/L菲啰嗪溶液，剧烈震荡混匀，在室温下放置10 min，测定反应物在562 nm处的吸光值As，以蒸馏水代替样品作对照测得吸光值为Ac。则样品对亚铁离子的螯合能力为Y/%=［1-As/Ac］×100。

1.8还原力的测定

参考Oyaizu等方法，有改动［14］。在试管中先加入2 mL的蛋白水解物溶液，然后再加入2 mL 0.2 mol/L 的pH6.6的PBS缓冲液，2 mL 1%铁氰化钾溶液摇匀，将试管放置在50℃水浴中反应20 min，再加入2 mL浓度为10%的三氯乙酸溶液，迅速震荡摇匀后在4000r/min条件下离心10 min。离心结束后，取2 mL上清液，2 mL蒸馏水和0.4 mL 0.1%的FeCl3溶液于试管中，迅速震荡摇匀，将混合液在50℃水浴下反应10 min，测定其在700 nm处的吸光值。

2　结果与讨论

2.1玉米谷蛋白的酶解

玉米谷蛋白在食品工业常用的近中性pH条件下的水溶性差，可将其用蛋白酶水解予以改善。复合蛋白酶是经枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵而制得，作用位点广泛，专一性不强。采用复合蛋白酶水解玉米谷蛋白，其水解度、可溶蛋白含量、蛋白回收率以及水解物的抗氧化活性如表1所示，水解物的分子量分布如图1所示。

表1　复合蛋白酶酶解玉米谷蛋白水解度、可溶蛋白含量、蛋白回收率及抗氧化活性Table 1　DH，soluble protein content，yield and antioxidative activities of corn glutelin hydrolysate by protamex

图1　复合蛋白酶水解玉米蛋白水解物的分子量分布Fig.1　Molecular weight distribution profiles of the hydrolysates of CGM by Protamex

利用复合蛋白酶水解玉米谷蛋白，水解物的水解度只达到（5.05±0.44）%，但是蛋白水解物有较好的可溶性蛋白含量及蛋白回收率，且水解物的溶解性从（1.99±0.28）%升高到（92.67±0.40）%，溶解性得到了非常显著的改善；而且水解物表现出了良好的抗氧化活性。用凝胶色谱法分析的水解物的分子量分布结果表明，当复合蛋白酶水解玉米谷蛋白的反应时间为120 min时，有21%的水解物分子量大于6.5 kDa，40%水解物的分子量分布在1 kDa～6.5 kDa之间，而分子量分布小于1 kDa的水解物占39%。

一般来说，小分子量的水解物更容易被人体吸收利用，也常常表现出更好的生理活性。考虑到上述用复合蛋白酶水解玉米谷蛋白的水解度偏低，水解物中分子量大于1 kDa的组分比例还较高，针对功能性消化不良症状人群，进一步将富含谷氨酰胺的蛋白质水解物进行体外消化，可使水解物释放出更小的肽段和功能性。

2.2一步消化加酶量对蛋白水解物抗氧化活性的影响

水解物经过胃蛋白酶的消化易分解出谷氨酰胺，谷氨酰胺可以有效改善胃肠道功能，且胃蛋白酶水解蛋白可将蛋白质多聚体水解成小分子的肽，使原来包埋于分子内部的具有抗氧化作用的氨基酸暴露出来。但胃蛋白酶的用量将直接影响着产物抗氧化活性的高低，当胃蛋白酶加酶量在0.1%～3%时，其对玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影响如表2所示。

表2　0.1%～3%的胃蛋白酶加酶量对玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影响Table 2　Effect of the concentration of pepsin between 0.1%and 3%on the antioxidant activities of hydrolysate from corn glutelin

由表2整体趋势看出，玉米谷蛋白水解物经胃蛋白酶进一步水解后，其亚铁离子螯合能力和还原力较一步消化前有小幅度的下降趋势，但其羟基自由基清除率明显提高。随着消化反应的进行，肽键的断裂和氨基酸侧链基团的暴露，都直接影响着消化产物的抗氧化活性。胃蛋白酶的加入使水解物生成更多的短肽，产物疏水性降低，从而使其与羟基基团等的作用增强，起到了强化抗氧化的效果。当胃蛋白酶加酶量为3%时产物的各项抗氧化活性指标均与加1%胃蛋白酶时接近，但都较加0.1%胃蛋白酶时反应产物的抗氧化活性高，说明胃蛋白酶加酶量的增加使玉米蛋白水解物消化的更完全，综合考虑，选定在1%～3%胃蛋白酶加酶量区间进一步优化来缩小蛋白酶的添加量范围，试验结果如表3所示。

由表3看出，产物的各项指标均随着胃蛋白酶加酶量的增加有先上升后下降的趋势，当添加1.5%的胃蛋白酶时，羟基自由基清除率、亚铁离子螯合能力及还原力均达到最大值，分别为（79.86±0.81）%、（63.32±1.20）% 及0.48±0.00。说明此时胃蛋白酶作用的位点已经水解完全，所以选定其为适合的胃蛋白酶加酶量。

2.3二步消化胰蛋白酶量对玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影响

水解物进入体内，经过胃进入小肠，胰蛋白酶存在于小肠中，可以将蛋白质水解为肽，进而分解为氨基酸，这是蛋白质能被机体吸收的必要过程。用加酶量为1%～7%的胰蛋白酶对玉米谷蛋白水解物经胃蛋白酶作用后的产物进行二步消化，试验结果如表4所示。

由表4看出，谷蛋白水解物一步消化产物经过胰蛋白酶进一步作用后，产物的羟基自由基清除率，还原力有轻微下降的趋势，但亚铁离子螯合能力较一步消化后产物明显升高，说明胰蛋白酶的加入阻碍了更多的Fe2+去催化反应形成氧自由基的渠道，增强产物的抗氧化活性，且随着胰蛋白酶加酶量的增大，各项抗氧化活性均有增大趋势，当加酶量达到7%时趋于稳定，综合考虑，当胰蛋白酶加酶量在5%～7%之间抗氧化活性更好，但此试验区间范围间隔较大，所以选定此区间进一步优化，以确定达到最佳抗氧化活性时的蛋白酶加酶量，试验结果如表5所示。

由表5看出，经过不同胰蛋白酶加酶量水解的产物各项指标的作用效果都较为接近，若选用高浓度的胰蛋白酶进行消化，造成了资源的浪费，且胰蛋白酶的增加并不能更利于机体的消化，综上，选用最少的加酶量即添加5%胰蛋白酶时为最优比例，既节约成本，又达到了很好的抗氧化效果，此时羟基自由基清除率为（55.88±0.94）%；亚铁离子螯合能力为（90.44± 0.67）%；还原力为0.40±0.01。

表31%～3%的胃蛋白酶加酶量对玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影响Table 3　Effect of the concentration of pepsin between 1%and 3%on the antioxidant activities of hydrolysate from corn glutelin

表41%～7%的胰蛋白酶加酶量对玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影响Table 4　Effect of the concentration of trypsin between 1%and 7%on the antioxidant activities of hydrolysate from corn glutelin

表55%～7%的胰蛋白酶加酶量对玉米谷蛋白水解物抗氧化活性的影响Table 5　Effect of the concentration of trypsin between 5%and 7%on the antioxidant activities of hydrolysate from corn glutelin

3　结论

本文以玉米蛋白粉为原料提取玉米谷蛋白，利用复合蛋白酶对其进行酶解，得到的玉米谷蛋白水解物经过胃蛋白酶及胰蛋白酶进一步消化处理，以羟基自由基清除率、亚铁离子螯合能力及还原力为指标对消化过程蛋白酶加酶量进行优化。复合蛋白酶水解玉米谷蛋白的水解物可溶性蛋白含量、蛋白回收率及水解度分别为（26.72±1.71）mg/mL、（54.41±3.26）%及（5.05± 0.44）%，其羟基自由基清除率、亚铁离子螯合能力及还原力分别达到（29.50±0.31）%、（73.33±0.62）%及0.50±0.01；1.5%胃蛋白酶消化上述水解物后，其羟基自由基清除率、亚铁离子螯合能力及还原力分别为（79.86±0.81）%、（63.32±1.20）%及0.48±0.00；5%胰蛋白酶二次消化酶解物的羟基自由基清除率、亚铁离子螯合能力及还原力分别为（55.88±0.94）%、（90.44± 0.67）%及0.40±0.01。玉米谷蛋白经复合蛋白酶和体外消化处理，生成富含谷氨酰胺的具有良好抗氧化活性的小肽混合物，其可作为适用于功能性消化不良症状人群的功能性食品基料。

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Effect of in vitro Digestion on the Antioxidant Activities of Hydrolysate from Corn Glutelin

XU Rui-xue，LIU Xiao-lan*，WANG Jun-tong，ZHENG Xi-qun
（College of Food and Biotechnology，Qiqihar University/Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province Normal University，Qiqihar 161006，Heilongjiang，China）

In present paper，the corn glutelin was extracted from corn gluten meal（CGM），and then it was hydrolyzed by protamax.Further，the hydrolysate was digested by pepsin and trypsin，the concentrations of pepsin and trypsin were optimized when antioxidant activities of the hydrolysates as an evaluation criteria for the preparation of hydrolysate，which were rich in Gln.The results showed that the yield of hydrolysate by protamex was （54.41±3.26）%，and its hydroxy radical scavenging capacity，ferrous ion chelating ability and reducing power were（29.50±0.31）%，（73.33±0.62）%and 0.50±0.01，respectively.The hydroxy radical scavenging capacity，ferrous ion chelating ability and reducing power of the hydrolysates after the digestion were（55.88±0.94）%，（90.44±0.01）%and 0.40±0.01，respectively.

corn glutelin；digest；pepsin；trypsin

2016-05-18

国家自然科学基金资助项目（31371726）；黑龙江省自然科学基金重点资助项目（ZD2016005）；黑龙江省高校科技成果产业化前期研发培育项目资助计划（1252CGZH05）；齐齐哈尔市科学技术局资助项目（GYGG-201208）；齐齐哈尔大学研究生创新科研项目（YJSCX2015-025X）

许瑞雪（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：微生物遗传学。

刘晓兰（1962—），女（汉），教授，博士，研究方向：微生物遗传学，农产品加工与贮藏工程。