李赫宇，赵玲（.天津市益倍建生物技术有限公司，天津300457；.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉43003）

巴西蜂胶对HepG2细胞增殖抑制活性研究

李赫宇1，赵玲2
（1.天津市益倍建生物技术有限公司，天津300457；2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

巴西蜂胶具有丰富而显著的生理活性，采用MTT法对巴西蜂胶提取物进行了HepG2细胞增殖抑制活性的研究，发现巴西蜂胶对HepG2细胞增殖具有良好的抑制活性，且呈显著的量效关系和时效关系，即剂量越大、药物作用时间越长，则对HepG2细胞的抑制率越高。

巴西蜂胶；HepG2细胞；增殖抑制活性

蜂胶（Propolis）是蜜蜂工蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合而成的一种天然粘稠物质。蜂胶的应用历史十分悠久，早在公元前300年，古埃及人就将其作为防腐物质及防治疾病的药物来使用。现代研究表明，蜂胶含有丰富的黄酮类、酚酸类及萜烯类化合物［1-3］，具有广泛的生物学活性和药理学活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、保肝、免疫调节等；目前已广泛用于医药、保健品、化妆品等领域［4］。蜂胶在全世界范围内均有分布，其中，巴西因其得天独厚的地理位置和丰富的生物资源而成为蜂胶生产大国。巴西蜂胶种类繁多，化学组成复杂，具有丰富而突出的生物学活性。自20世纪90年代以来，巴西蜂胶的化学组成及其生物学活性引起了国内外蜂胶研究者的广泛关注。恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一，其发病机制及防治措施多种多样，本文针对巴西蜂胶抗肝癌HepG2细胞增殖活性进行研究，以期发现较好活性，为肝癌防治提供参考。

1　试验材料

1.1材料和试剂

巴西蜂胶由天津市益倍建生物技术有限公司提供；噻唑蓝（MTT）：美国Sigma公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程公司；二甲基亚砜：Sigma公司；RPMI1640、胰蛋白酶：Gibco公司。

1.2细胞株

肝癌HepG2细胞株：华中科技大学提供。

1.3试验仪器

酶标仪：美国 PerkinElmer公司；CO2培养箱：W200IR型，美国SIM公司；倒置显微镜：Olympus公司；超净工作台：ZHJH-1112B型，上海智诚分析仪器制造有限公司。

2　方法

2.1药物制备

巴西蜂胶以80%乙醇浸泡24 h，低温回收乙醇，制得提取物。巴西蜂胶提取物适量以1 mL（DMSO）二甲基亚砜溶解，过滤除菌，置4℃冰箱保存，临用前用培养基稀释成所需浓度。

2.2HepG2细胞培养

将恒温水浴锅的温度设置为37℃，在-80℃的低温冰箱里取出已冻存的肝癌HepG2细胞株，放入恒温水浴锅中进行水浴，同时不停摇晃，使细胞迅速融化。3 min后冻存管内成液体状态，取出后防止污染可用酒精棉擦拭。放入超净工作台后，取出离心管并加入3 mL的培养基，反复吹打后将冻存管内细胞悬液加入离心管里，吹匀后放入离心机（1 500 r/min，10 min）。离心后在超净工作台内操作，倒掉离心管内的上清液，加入1 mL培基后分装到3个中型培养瓶内培养，每瓶加入6 mL培养基。将中型培养瓶放入37℃、5%CO2培养箱内培养。

2.3MTT法测定抑制率

2.3.1铺板

观察细胞状态，细胞成对数生长期后，用胰酶消化，倒掉胰酶后，加入3 mL培养基终止消化，用吸管反复吹打但不要产生泡沫，将瓶壁的细胞吹落。吹匀后进行细胞计数，经计算配成3×104个/mL悬液，将细胞悬液接种于96孔板内，每孔100 μL（3×104个/mL）．放入37℃、5%CO2培养箱内培养24 h。

2.3.2给药

在超净工作台内用RPMI 1640稀释巴西蜂胶提取物母液，配置成6个质量浓度，分别为2.18、1.09、0.5 45、0.2727、0。136 35、0.068 175 g/mL。每个质量浓度设置6个平行孔，每孔加入100 μL药物，空白孔加100 μL（3×104cell）的细胞悬液后，加入100 μL的RPMI 1640，平行条件下铺3块板。

2.3.3MTT法测定

将分别培养24、48、72 h的96孔板取出，倒掉板孔内液体，再在每孔加入10 μL MTT，放入培养箱内继续培养4h后取出96孔板。吸去孔内MTT后，每孔再加入110 μL的Formazan溶解液，震荡仪上震荡10 min，使孔内结晶充分溶解。570 nm波长下酶标仪检测。

2.3.4计算公式

HepG-2细胞生长抑制率/%=（1-给药孔OD值/空白孔OD值）×100

2.3.5数据处理

本实验采用SPSS19.0进行分析，使用ANOVA方差分析方法、两样本均数比较用t检验，结果以x±S表示。

3　结果

MTT结果显示不同质量浓度的巴西蜂胶分别培养24、48、72 h后，对HepG2细胞有明显抑制作用。当巴西蜂胶浓度大于等于0.272 7 mg/mL并培养48小时和72小时后，对HepG2细胞的抑制率均大于50%。当浓度增大为2.18 mg/mL时，作用24 h其抑制率即大于50%，具体数据见表1。巴西蜂胶相对应的IC50值经计算，分别为1.395 7、0.323 6、0.025 2mg/mL。各实验组（P＜0.05）均有统计学意义，随着浓度增大和作用时间延长，巴西蜂胶对HepG2细胞增殖抑制存在着显著的剂量-效应关系和时间-效应关系（P＜0.05），见图1。

表1　巴西蜂胶对HepG2细胞的抑制率（x±SD，n=6）Table 1　Inhibitory rate of Brazilian propolis on HepG2 cells（x±SD，n=6）

图1 巴西蜂胶对HepG2细胞的抑制率曲线Fig.1　Inhibition curve of Brazilian propolis on HepG2 cells

4　结论与讨论

通过本实验可以看出，巴西蜂胶体外具有良好的抑制HepG2细胞增殖的活性，且随着浓度的增加，作用时间的延长，对HepG2细胞的抑制率越高，在浓度为2.18 mg/mL时，其作用48 h和72 h的抑制率分别可达81.67%和93.86%，但是其在体内是否较好的抗肝癌活性及作用机制尚不清楚，仍需进一步深入研究。

我国是一个肝病大国，每年的肝癌发病率及病死率均占全球一半以上［5］，现有的抗肝癌药物大都存在各种毒副作用。蜂胶是卫生部公布的可用于保健食品中的物品之一，具有较高的安全性［6］。且文献报道其还有提高免疫的作用，在人们日益追求健康的时代，具有极大的开发为防治肝癌的药品及保健食品的潜力，这对人类健康有着非常重要的现实意义。

［1］张翠平，胡福良．蜂胶中的黄酮类化合物［J］.天然产物研究与开发，2009，21（6）：1084-1090

［2］张翠平，胡福良．蜂胶中的萜类化合物［J］.天然产物研究与开发，2012，24（7）：976-984

［3］Zhang C，Wang K，HU Fuliang．Phenolic acid in propolis［J］．Chin J Mod Appl Pharm，2013，30（1）：102-105

［4］VS Bankova，SLD Castro，MC Marcucci.Propolis：recent advances in chemistry and plant origin［J］.Apidologie，2000，31（1）：3-15

［5］梁宏元，卢再鸣.原发性肝癌综合介入治疗现状与困惑［J］.临床肝胆病杂志，2016，32（1）：44-48

［6］程晓雨，胡福良.我国蜂胶保健食品概况［J］.中国蜂业，2015，66 （4）：45-47

Study on the Proliferation Inhibitory Activity of Brazilian Propolis on HepG2 Cell

LI He-yu1，ZHAO Ling2
（1.Tianjin Ubasic Health Nutrition Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China；2.School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，Hubei，China）

The Brazilian propolishas rich and significant physiological activity.The proliferation inhibitory activityof Brazilian propolis extracts on HepG2 cell was studied with the MTT assay.It was found that the Brazil propolis had good inhibitory activity on the proliferation of HepG2 cells，and showed a significant dose effect and time effect relationship，that was，the higher the dose，the longer the action time，the higher the inhibition rate of HepG2 cells.

Brazil propolis；HepG2 cell；proliferation inhibition activit

2016-07-12

李赫宇（1982—），男（汉），工程师，硕士研究生，研究方向：天然药物和功能性食品的开发。