张　寿,常　兰,雷乃虎,严作云,李福寿,任青加,颜廷胜

(1.青海大学农牧学院动物医学系,青海西宁810016;2.青海省都兰县兽医站,青海都兰816100;3.青海省天峻县兽医站,青海天峻817200)

牦牛乏情期和怀孕期卵巢微血管密度的测定

张寿1,常兰1,雷乃虎1,严作云2,李福寿3,任青加3,颜廷胜3

(1.青海大学农牧学院动物医学系,青海西宁810016;2.青海省都兰县兽医站,青海都兰816100;3.青海省天峻县兽医站,青海天峻817200)

为进一步保护牦牛资源和提高牦牛繁殖能力提供基础资料,本研究对牦牛乏情期和怀孕期卵巢中微血管进行了研究.采用免疫组织化学技术和图象分析方法对牦牛乏情期卵巢、怀孕期卵巢微血管密度进行测定.结果乏情期和怀孕期牦牛卵巢微血管光密度值不同.怀孕期有黄体侧卵巢的黄体处微血管光密度值最大,怀孕期有黄体侧卵巢微血管光密度值次之,乏情期卵巢、怀孕期无黄体侧卵巢和怀孕期有黄体侧卵巢的无黄体处微血管光密度值为较小,且后三者之间差异不显著(P>0.05),而怀孕期有黄体侧卵巢的黄体处、怀孕期有黄体侧卵巢的微血管光密度值与其他各组间差异均显著(P<0.05).

牦牛;卵巢;微血管;光密度值

动物卵巢的功能直接影响着其繁殖性能,而决定卵巢功能的主要因素之一就是卵巢微血管密度(microvessel density,MVD).微血管密度大,血液供应充足,卵巢上卵泡的发育、黄体的形成,以及激素的分泌就有了保障.国内外学者对不同动物的卵巢结构、微血管的变化等进行了许多研究,如陈洋[1]等探讨了绵羊发情周期不同时期各级卵泡微血管生成状态及卵泡微血管生成与卵泡发育的关系,Imanirad P等[2]、孙健等[3]对小鼠卵巢微血管进行了研究.但迄今为止还未见到有关牦牛卵巢微血管的研究报道,为进一步保护牦牛资源和提高牦牛繁殖能力提供基础资料,我们进行了此项研究.

1　材料与方法

1.1试验动物选择生活在青海省天峻县(平均海拔4 000 m)临床健康的乏情期和怀孕期(怀孕2个月)成年(5岁)母牦牛各5头,放血致死,迅速取两侧卵巢,4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定.

1.2主要仪器LEICA RM2235手摇式切片机(德国);KH-P2恒温摊片烤片机;Olympus BX51型光学显微镜(日本);Olympus BA310图象采集系统(日本);IMAGE PRO PLUS 6.0图象分析系统(美国).

1.3主要试剂多聚甲醛,苏木精染液,酒精,二甲苯,兔抗CD34抗体(批号:BA0532),UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒(兔)(KIT-9706批号:1310169706),DAB显色试剂盒(批号:08H22C22).

1.4免疫组织化学染色方法经4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定的卵巢组织,常规石蜡包埋、切片,片厚4 μm;切片脱蜡至水,蒸馏水洗3次,每次3 min,再用0.01 mol/L PBS冲洗3次,每次8 min,以下每步骤间均以0.01 mol/L PBS充分洗涤;修复液高压修复2 min;滴加内源性过氧化酶阻断剂37℃温箱孵育20 min;加非免疫动物血清(羊) 37℃温箱孵育45 min,不洗;入兔抗CD34多克隆抗体(1∶200),4℃冰箱过夜;滴加生物素标记的羊抗兔IgG,37℃温箱孵育2 h;滴加链霉菌抗生素蛋白-过氧化酶,37℃温箱孵育30 min;用DAB显色剂显色6 min,蒸馏水终止反应;苏木精染液复染、脱水、透明、封片.

1.5观察与数据统计在光学显微镜下400倍放大观察切片,每枚卵巢选3张切片,每组共15张,每张切片选6-7个微血管密度大、染色深的不重复视野,用图象采集系统采集图片,所采集的图片用IMAGE PRO PLUS 6.0软件(德国)进行累计光密度值的测定,每组累计光密度值中从大到小依次取60个数据进行单位光密度值计算,所得数据用SPSS 17.0软件做统计学处理,结果均以均数±标准差表示,并对试验数据进行单因素方差分析并比较.

2　结果

2.1卵巢微血管形态和分布免疫组化染色结果显示,卵巢中有大量微血管存在,主要分布于卵巢皮质、髓质和黄体.卵巢皮质和髓质中的微血管在乏情期和怀孕期的分布和形态大致相同.但黄体内微血管在分布和形态上与卵巢皮质和髓质的有明显区别,黄体内的微血管染色深、管腔较大(见中插彩版图1).

2.2牦牛乏情期和怀孕期卵巢微血管密度乏情期和怀孕期牦牛卵巢微血管光密度值不同.怀孕期有黄体侧卵巢的黄体处微血管光密度值最大,怀孕期有黄体侧卵巢微血管光密度值次之,乏情期卵巢、怀孕期无黄体侧卵巢和怀孕期有黄体侧卵巢的无黄体处微血管光密度值为较小,且后三者之间差异不显著(P>0.05),而怀孕期有黄体侧卵巢的黄体处、怀孕期有黄体侧卵巢的微血管光密度值与其他各组间差异均显著(P<0.05)(见表1).

表1　牦牛乏情期和怀孕期卵巢微血管密度

3　讨论

血管新生(angiogenesis)是指在机体生长发育过程中或创伤修复、缺血、缺氧和炎症等情况下,原有微血管内皮细胞(endothelial cellE,C)经过出芽、迁移、增殖与基质重塑等最终形成新毛细血管的过程.在正常生理条件下,血管增生主要出现于卵巢、子宫、胎盘等处,且呈周期性变化,这与生殖功能的调节密切相关.在排卵前,原始卵泡主要依靠间质血管供血,并没有血管网存在.原始卵泡开始发育后,微血管出现在卵泡膜层,而且随着卵泡由原始卵泡发育为窦前卵泡及由窦前卵泡进一步发育为窦状卵泡的过程,微血管的密度也同步增加.在卵泡发育过程中,血管生成持续进行,最终形成巨大的微血管网,但是都仅限于分布在卵泡膜层,并未突破基膜进入颗粒细胞层.排卵后,即黄体发育早期,血管增生最为明显.随着卵泡液的流出,卵泡壁塌陷,由于颗粒细胞层和卵泡内膜细胞之间的去聚合作用,内皮细胞合成分泌的蛋白酶降解基膜,基膜消失,血液流入卵泡腔中,形成早期黄体,随后原卵泡膜中的血管内皮细胞开始以出芽的形式迁移进黄体化的颗粒细胞区域,紧接着就进行剧烈的血管生成,即内皮细胞增殖、相互粘附并连接,而后形成管腔样结构,随着基质重塑和平滑肌细胞的包绕及血管的相互吻合形成血管网,最终扩散到整个黄体组织,为黄体的发育提供必需的营养物质及激素[4-6].早期黄体快速形成致密的毛细血管网可以确保产生激素的细胞获得氧气、营养、并合成激素,同时释放大量的激素用于早期妊娠的建立和维持[4-5].本次研究表明,牦牛怀孕早期(2个月)黄体处微血管密度最大,且怀孕期黄体侧卵巢的微血管密度明显大于发情期卵巢,说明牦牛怀孕早期有黄体侧卵巢微血管大量增加有利于黄体的形成和孕酮的分泌,这对高海拔低氧环境下牦牛的正常怀孕具有十分重要意义.另外本次研究得出牦牛怀孕期无黄体侧卵巢、怀孕期有黄体侧卵巢无黄体处的微血管和乏情期卵巢之间无显著性差异,这说明牦牛怀孕后,无黄体侧卵巢和乏情期的卵巢一样都处于静止状态,不随怀孕的生理变化而产生微血管的增生,这可能是牦牛卵巢微血管变化的特点,也是牦牛的发情表现为季节性发情的原因之一.

[1]陈洋,王典,曹颖楠,等.绵羊发情周期卵巢微血管密度的观察[J].中国兽医学报,2012,04:637-640.

[2]Imanirad P,Solaimani K P,Crisan M,et al.HIF1α is a regulator of hematopoietic progenitor and stem cell development in hypoxic sites of the mouse embryo[J].Stem Cell Research,2014,12(1):24-35.

[3]孙健,肖红卫,郑新民,等.不同剂量PMSG对未性成熟小鼠卵巢发育的影响[J].华中农业大学学报,2009,28(4):450-452.

[4]罗倩萍,张正红,陈佳洁,等.VEGF在家畜黄体早期发育过程中对血管生成的调控作用[J].家畜生态学报,2011,06:124-128.

[5]吴艳青,张正红,罗倩萍,等.HIF-1在卵巢黄体发育过程中对血管新生的调控作用[J].中国细胞生物学学报,2012,10: 1042-1048.

[6]况立洪.转录因子Nrf2对大鼠心肌微血管内皮细胞在血管生成中作用的影响及其机制的体外研究[D].重庆:第三军医大学,2013.

Determination of yak Microvessel Density Anestrus and Pregnancy in ovariand

ZHANG Shou1,CHANG Lan1,LEI Nai-hu1,YAN Zuo-yun2,LI Fu-shou3,REN Qing-jia3,YAN Ting-sheng3
(1.College of Agriculture and Animal Husbandry in Qinghai University,Xining 810016,China; 2.Veterinary Statiox in Dulan lounty,Dulan 810016,China;3.Veterinary Station in TianJun County,Tianjun 817200,China)

Microvascular optical density values on anestrus and pregnancy ovarian of Yak were determined and compared to provide basic data for further protection of resources and improve the reproductive capacity of yak.Microvascular optical density values on anestrus and pregnancy ovarian of Yak were analyzed by using immunohistochemical technique and image analysis meth⁃od.There was a difference in microvascular optical density value on anestrus and pregnant ovarian of yak.The microvessel density in corpus luteum was maximum and then was the ovarian with corpus luteum.anestrus ovarian and no corpus luteum ovarian and ar⁃ea of except corpus luteum in corpus luteum ovarian were smaller,but there was no significant difference between the three(P> 0.05).The microvessel density in corpus luteum and ovarian with corpus luteum were significantly difference between the value with other groups,respectively(P<0.05).

yak;ovarian;microvessel;optical density value

CHANG Lan

S823.8+5

A

0529-6005(2016)06-0039-02

2015-03-06

国家自然科学基金(31360590);青海省科技应用基础项目(2014-ZJ-711)

张寿(1964-),男,教授,本科,从事动物医学教学及科研工作,E-mail:895169158@qq.com

常兰,E-mail:changlan0123@163.com