王　星,吴艳艳,周　婷,刘进祖,贾慧茹,代平礼,王　强,潘　丁,徐书法

(1.北京市蚕业蜂业管理站,北京西城100029;2.中国农业科学院蜜蜂研究所农业部授粉昆虫生物学重点开放实验室,北京海淀100093;3.北京工商大学食品学院环境科学与工程系,北京海淀100048)

蜜蜂幼虫血淋巴营养成分差异可能影响狄斯瓦螨的寄主选择

王星1,吴艳艳2,周婷2,刘进祖1,贾慧茹2,代平礼2,王强2,潘丁3,徐书法2

(1.北京市蚕业蜂业管理站,北京西城100029;2.中国农业科学院蜜蜂研究所农业部授粉昆虫生物学重点开放实验室,北京海淀100093;3.北京工商大学食品学院环境科学与工程系,北京海淀100048)

本研究着重从狄斯瓦螨依赖度极高的食物着手,较全面地比较了4种蜜蜂幼虫血淋巴中与螨繁殖高度相关的营养物质含量差异.结果显示,对狄斯瓦螨吸引力(繁殖力)最弱的中华蜜蜂工蜂幼虫血淋巴中,蛋白质含量显著低于其他3种幼虫,而游离氨基酸含量显著高于其他3者;对狄斯瓦螨吸引力(繁殖力)最高的中华蜜蜂雄蜂幼虫血淋巴中,Cu元素和维生素E(生育酚)含量是4种幼虫中最高的,分别与其他3者具有显著性差异.研究结果证实,与螨繁殖相关的营养成分含量的差异与螨寄生特性具有高度一致性,这为进一步分析螨的营养需求和寻求从营养上抑制螨繁育的方法打下良好的基础.

狄斯瓦螨;血淋巴;寄主选择

狄斯瓦螨是困扰养蜂业生存发展最严重的寄生虫害[1].狄斯瓦螨对于寄主的选择具有明显的偏好性.排除中华蜜蜂清理能力的因素,狄斯瓦螨更偏好寄生并繁殖于东方蜜蜂的雄蜂幼虫,与此相比,对西方蜜蜂的工蜂和雄蜂幼虫的寄生偏好略低(此两者相近),而东方蜜蜂的工蜂幼虫对狄斯瓦螨的吸引力最弱[2].

东方蜜蜂对螨的抗性主要是在长期的协同进化中产生的[3],螨的存在会激发东方蜜蜂强烈的清理行为[4],这可能与蜂房信息素的存在相关.还有研究表明,蜜蜂幼虫封盖历期、巢房大小和新旧程度[5-7]、蜜蜂保幼激素含量[5]、化学信息素等[8]都会影响螨的繁殖能力.

狄斯瓦螨对其寄主血淋巴中营养成分依赖程度非常高,其生命活动所需的物质、能量都源自其寄主(蜜蜂的幼虫或成蜂)的血淋巴[9-10],所以我们推测狄斯瓦螨对不同蜂种不同职能蜂寄生的偏好和繁殖能力的差异可能与不同幼虫血淋巴中营养物质含量的差异有关[11].基于此推测,我们分别测定了西方蜜蜂和东方蜜蜂的工蜂和雄蜂幼虫血淋巴中与繁殖高度相关的蛋白质、游离氨基酸、游离脂肪酸、海藻糖、无机元素和维生素E的含量,并进行了差异比较.

1　材料与方法

1.1蜜蜂品种及产地意大利蜜蜂和中华蜜蜂,产自北京密云县,两个蜂场相距约25 km.

1.2蜜蜂幼虫日龄选择选取10日龄的大幼虫.因为狄斯瓦螨进入蜜蜂幼虫巢房后,在封盖后60 h后开始产卵,此前为狄斯瓦螨进入蜂房后准备繁殖的关键时期,所以刚封盖幼虫的血淋巴营养成分对狄斯瓦螨的繁育至关重要.

1.3蜜蜂幼虫血淋巴抽取方法将幼虫背面朝上置于干净滤纸上,用拇指和食指绷紧幼虫的表皮,以昆虫针轻轻刺破幼虫背面靠头的部位(避开消化道,且刺的不要过深),当血淋巴呈滴状渗出时用自制的针头状毛细管吸取.将毛细管中的蜜蜂幼虫血淋巴吹入加有少量苯基硫脲的1.5 mL离心管中.因为血淋巴极易氧化,故此操作在冰浴条件下进行,并于-20℃或-70℃保存.

1.4蛋白质测定方法Bradford法(考马斯亮蓝法),本试验使用了蛋白质测定试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司E111-01/02),蜜蜂幼虫血淋巴稀释10倍后测定.

1.5游离氨基酸测定方法将蜜蜂幼虫血淋巴用5%磺基水扬酸稀释10倍,充分混匀,离心机10 000 r/min离心10 min,析出沉淀物,取上清液直接使用氨基酸自动分析仪进行测试.

1.6游离脂肪酸测定方法总游离脂肪酸含量采用铜试剂比色法,使用试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司,PW1,50T/48S),进行测定.

1.7海藻糖测定方法蒽酮比色法,使用试剂盒定前需稀释100倍.

1.8微量元素测定方法Cu、Zn、Se、Mn 4种元素使用电感耦合等离子体质谱法进行测定,工作参数:雾化气流量:0.96 L/min;辅助气流量:1.80 L/min;等离子体气流量:15.0 L/min;驻留时间: 100 ms;样品提升量:1 mL/min;扫描方式:单点跳峰;分辨率:0.7～0.9 aum.

P、Fe、Mg、Na、K、Ca 6种元素使用等离子体发射光谱法进行测定,工作参数:功率:1 150 KW;冷却气:15 L/min;辅助气:0.5 L/min;载气:0.2 Mpa;垂直观测高度:12 mm.

1.9维生素E测定方法高效液相色谱法测定. 1.10数据统计方法指标3组重复,数据采用平均值±SEM表示,并通过单因素方差分析(oneway ANOVA)和Scheffe法进行比较(P<0.05).

2　结果与分析

本试验对中华蜜蜂工蜂(ACW)、中华蜜蜂雄蜂(ACD)、意大利蜂工蜂(AMW)、意大利蜂雄蜂(AMD)幼虫的血淋巴中营养物质含量进行了比较测定.结果如下.

2.1蛋白质和游离氨基酸测定结果对32种常见游离氨基酸的含量进行了测定,结果显示,中华蜜蜂的雄蜂与意大利蜜蜂的工蜂、雄蜂幼虫血淋巴中蛋白质和氨基酸的含量都比较接近(分别为2996±0.099,2.807±0.100 μg/μL和2.509±0.147 μg/μL),但是中华蜜蜂的工蜂幼虫血淋巴中蛋白质的含量(1.691±0.114 μg/μL)显著低于其他3种幼虫(P<0.001),而游离氨基酸的总含量则显著高于其他3种幼虫(P=0.034),尤其是苏氨酸(P= 0.002)、甘氨酸(P=0.001)、丙氨酸(P<0.001)、异亮氨酸(P<0.001)、苯丙氨酸(P<0.001)和氨基丁酸(P<0.001)的含量远高于其他3种幼虫,这可能是在中华蜜蜂工蜂幼虫发育阶段中大量蛋白质水解导致的.

2.2游离脂肪酸测定结果在4种幼虫血淋巴内,AMW游离脂肪酸含量最高(481.20±32.6 μmol/L),与其他3种幼虫对应含量具有显著性差异(P< 0.001),其中:AMD游离脂肪酸含量327.07±25.7 μmol/L,ACW游离脂肪酸含量78.95±5.32 μmol/L,ACD对应含量最低,为60.15±4.90 μmol/L.

2.3海藻糖测定结果试验结果显示,ACW和ACD幼虫血淋巴中海藻糖含量相近且较高,分别达到0.61±0.032 mg/L和0.60±0.04 mg/L,而AMD和AMW对应值相近且较低(分别为0.52±0.01 mg/L和0.52±0.02 mg/L);中华蜜蜂幼虫(ACW和ACD)血淋巴中海藻糖浓度显著高于意大利蜜蜂幼虫(AMW和AMD)(P<0.05).

2.4微量元素测定结果对10种重要微量元素进行了检测,结果显示,ACD幼虫Cu含量和ACW幼虫Zn含量是4种幼虫中最高的,分别与其他3者具有显著性差异;AMW幼虫Fe含量、AMD幼虫K含量ACW幼虫Na含量和ACW幼虫Se含量是4种幼虫中最低的,同样与其他3者具有显著性差异;Ca、Mg和P在4种幼虫中含量相近,不具有显著性差异.

表1　4种蜜蜂幼虫血淋巴中微量元素含量对比(单位:μg/g)

2.5维生素E测定结果维生素E是对动物生殖具有重要作用的维生素,分别对3种维生素E的同分异构体(维生素E-α、δ和γ)进行了含量测定,结果显示,ACD的维生素E总含量最高,达到6.08±0.41 μg/mL,显著高于其他3种幼虫(P< 0.001),其中:ACW血淋巴中维生素E含量为1.74±0.10 μg/mL,AMW血淋巴中维生素E含量为1.12±0.06 μg/mL AMD血淋巴中维生素E含量为1.23±0.09 μg/mL.

3　讨论

蛋白质是构成细胞的基本有机物,是生命活动的主要承担者,氨基酸则是合成蛋白质所需的最基本物质,两者都是生物体所需的重要营养物质.曾有研究表明,狄斯瓦螨体内没有蛋白水解酶,直接利用寄主血淋巴蛋白,不需前期消化;也可以利用寄主血淋巴蛋白进入卵母细胞,促进卵子发育;第一若虫也直接利用寄主的蛋白.由此,我们推测蛋白质对于螨的繁殖和其他生命活动更加重要,对氨基酸的利用率并不太高.由于中华蜜蜂工蜂幼虫血淋巴蛋白质含量偏低(同时因为蛋白质的分解导致了游离氨基酸含量高),不足以提供狄斯瓦螨繁殖所需的蛋白质营养,所以导致狄斯瓦螨自然感染条件下在中华蜜蜂工蜂房中不育,而人工侵染条件下其在中华蜜蜂工蜂房中繁殖率偏低.

在能源物质方面,游离脂肪酸(FFA)是重要的能量代谢物质,与动物的持久运动能力有关,从试验结果来看,同蜂种的工蜂幼虫比雄蜂幼虫血淋巴游离脂肪酸含量高,而意大利蜂幼虫的血淋巴游离脂肪酸含量要比中华蜜蜂游离脂肪酸含量高很多(3～5倍),造成这一现象的原因还不清楚,可能跟蜂种发育过程中的脂类物质和能量代谢不同有关,推测这可能是造成意大利蜂飞行和采集能力较强的原因之一.昆虫血淋巴中含有高浓度的海藻糖,这是昆虫血淋巴的重要生化特征,也是昆虫抗寒能力的重要指标.本研究显示,中华蜜蜂幼虫血淋巴中海藻糖的浓度明显高于意大利蜂,所以血淋巴中的高浓度海藻糖含量可能是中华蜜蜂比意大利蜂更耐寒的原因之一.综上分析,蜜蜂幼虫血淋巴中的主要能源物质含量差异对螨的寄生繁殖能力的差异方面看不出相关性.

在微量物质方面,包括微量无机元素和维生素等,经过多次预试验,我们发现不同产地的4种蜜蜂幼虫血淋巴中微量物质的变化是很大的,这可能跟不同地区的蜜源植物不同有关,蜜蜂采集的花蜜和花粉不同,所获得的微量物质也有显著的差别.但令我们感兴趣的是,多个产地的蜜蜂幼虫,其血淋巴中铜离子和维生素E的差异趋势是基本相同的,试验结果显示,中华蜜蜂的雄蜂幼虫血淋巴中与繁殖能力密切相关的铜元素和维生素E含量均显著高于其他3个蜜蜂幼虫,这与螨寄生的差异性显示出高度的一致性,即螨在自然侵染条件下,对中华蜜蜂雄蜂幼虫更具偏好性,在人工侵染蜜蜂幼虫条件下,在中华蜜蜂的雄蜂房内繁殖率更高.目前对狄斯瓦螨的营养发育研究还非常有限,但是通过对其依赖性极高的食物(蜜蜂幼虫血淋巴)组分分析,发现其中与繁殖相关的重要营养物质与狄斯瓦螨的寄生能力差异存在着高度相关性,所以,我们推测蜜蜂幼虫血淋巴组分的差异极有可能导致狄斯瓦螨的寄生偏好性,影响其对寄主的选择.当然,这一结论还需要今后更多的试验来证实.我们今后开展的研究工作期望能够发现对螨的繁殖起关键作用的营养元素需求量和底限,或者能够找到抑制螨繁殖的关键因素,从而从营养学角度找到控制螨繁殖的方法.

表2　中华蜜蜂幼虫血淋巴组分含量特征与意大利蜂螨繁殖能力的相关比较

[1]Ting Zhou,Denis L.Anderson,Zachary Y Huang,et al.Identifi⁃cation of Varroa mites(Acari:Varroidae)infesting Apis cerana and Apis mellifera in China[J].Apidologie,2004(35):645-654.

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[8]Norberto Milani,Giorgio Della Vedova,Francesco Nazzi.(Z)-8-Heptadecene reduces the reproduction of Varroa destructor in brood cells[J].Apidologie,2004,35:265-273.

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Thedifferenceof thenutritional components in hemolymph of honeybee larva may affected thehost preferenceofVarroa destructor

WANG Xing1,WU Yan-yan2,ZHOU Ting2,LIU Jing-zu1,JIA Hui-ru2,DAI Ping-li2,WANG Qiang2,PAN Ding3,XU Shu-fa2
(1.Beijing apiculture and sericulture station,Beijing 100029,China;2.Key Laboratory of Pollinating Insect Biology of Ministry of Agriculture,Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Science,Beijing 100093,China;3.Environmental Science and Engineering,School of Food and Chemical Science,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

The varroa destructor a parasite for honey bee is the top threaten to the beekeeping industry world widely.Previous studies have demonstrated that the propensity of Varroa destructor to its hosts is different,implying that the difference of nutritional components in hemolymph of honeybee larvas may affect the host preference of Varroa destructor.In this study,larvas of both work⁃ers and drones from two bee species,Apis cerana and Apis mellifera,were included.The nutrients related with Varroa destructor re⁃production were compared.Our data indicated the protein level of Apis cerana worker larva was significantly lower than the others,while amino acids were higher.Moreover,free fatty acid level in Apis mellifera worker larva,was the highest.Cu content and Vita⁃min E in Apis cerana drone,as well as Zn in Apis cerana worker larva,were the highest in all the four types.In conclusion,our data confirmed that nutritional components from different bee larva were highly consistent with host preference of Varroa destructor.Our findings will be beneficial for analyzing the nutritional requirement for mites of Varroa destructor and preventing the mite reproduc⁃tion by nutritional control manner.

Varroa destructor;Hemolymph;host preference

XU Shu-fa

S895

A

0529-6005(2016)06-0010-03

2015-09-09

国家科技支撑项目(2011BAD33B04);国家自然科学基金项目(31101772)

王星(1980-),男,工程师,硕士,从事蜂业行业管理工作,E-mail:150488276@qq.com

吴艳艳(1984-),女,助理研究员,博士,从事蜜蜂病害研究工作,E-mail:mifeng9876@163.com

注:吴艳艳与王星对本文具有同等贡献

徐书法,E-mail:xushufa@caas.cn