邓胜朝,冯嘉萍,崔　进,陈 耀,崔甜甜,白小磊,石庆伟,张桂红

(华南农业大学兽医学院,广东广州510642)

2014年华南地区PRRSV ORF5基因的遗传变异分析

邓胜朝,冯嘉萍,崔进,陈 耀,崔甜甜,白小磊,石庆伟,张桂红

(华南农业大学兽医学院,广东广州510642)

为了研究华南地区PRRSV的遗传变异情况,本研究对2014年华南地区16份PRRSV阳性样品的ORF5基因进行了RT-PCR扩增、克隆和测序,并将其进行序列比对和遗传进化分析.结果表明:本研究检测的16株PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性为82.8%～100%,与JXA1,CH-1a以及VR2332核苷酸同源性分别为84.4%～99.3%,85.9%～ 95.0%和83.6%～89.2%.遗传进化树分析显示,所获得16株毒株序列中有13株属于以JXA1为代表的变异株亚群,另外3株属于以GM2,QYYZ为代表的新分支亚群.GP5氨基酸位点分析发现新分支亚群存在较为广泛的变异,尤其在信号肽区,诱导表位,中和表位及高变区.

猪繁殖与呼吸障碍综合征;华南地区;ORF5;遗传变异

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种急性接触性传染病,以母猪发热、流产、胎儿木乃伊化、产死胎、弱仔等繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征,是目前世界上对养猪业带来重大经济损失的一种传染性疾病.目前,PRRSV主要分为两种基因型,分别为以LV为代表株的欧洲型(EU)及以VR2332为代表株的美洲型(NA),我国主要流行株为美洲型[1].

PRRSV属于套式病毒目(Nidovirales),动脉炎病毒科(Arteriviridae),动脉炎病毒属(Arterivirus),基因组全长约15 kb,包含10个开放性阅读框(ORFs),即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5a、ORF5、ORF6和ORF7.ORF5编码的糖蛋白GP5是PRRSV最主要的保护性抗原蛋白,具有受体识别作用和诱导细胞凋亡的功能.在所有结构蛋白中,GP5蛋白遗传变异性最大[2],常用于作为流行病学监测的标志性蛋白.通过了解华南地区2014年ORF5基因的遗传进化关系,对于华南地区PRRS的防控提供参考依据.

1　材料与方法

1.1病料样品2014年,在华南不同地区的不同养殖场采集疑似PRRSV样品(肺脏、肝脏、肾脏、淋巴结、血清等),经RT-PCR检测为阳性的样品中选取16份进行研究分析.

1.2主要试剂RNA酶抑制剂、dNTP、Ex Taq DNA聚合酶、M-MLV,以及pMD18-T Vector,均购自TaKaRa公司;TRIZol Reagent,购自Invitrogen公司;DNA凝胶回收试剂盒,购自Omega公司;隆宿主菌E.coli DH5α由华南农业大学兽医学院农业部兽用疫苗创制重点实验室保存.

1.3样品RT-PCR鉴定将约2.0 g组织样品用生理盐水研磨成1∶5的组织匀浆,反复冻融3次后离心取上清液,参照TRIZol LRS Reagent总RNA提取试剂的使用说明书提取病毒总RNA,进行RT-PCR鉴定.

1.4ORF5基因的扩增与测序根据GenBank中发表的PRRSV基因组序列,设计扩增PRRSV ORF5基因的引物ORF5-F:5′-TGAGACCATGAGGTGGGC-3′,ORF5-R:5′-GAAAACGCCAAAAGCACC-3′PCR,按照以下反应条件为:94℃5 min,1个循环;94℃1 min,53℃30 s,72℃1 min,30个循环;最后72℃延伸10 min.进行PCR扩增,琼脂糖凝胶回收性产物,并克隆至pMD18-T载体中,连接产物转化DH5α感受态细胞,挑取单个菌落,进行PCR鉴定,阳性重组菌液送往上海英骏生物技术有限公司进行序列测定.

1.5基因序列遗传进化分析应用DNAStar和Mega5.0对扩增的核苷酸序列与从GenBank中选取的参考毒株的序列进行同源性比较,绘制系统进化树,并将所测序列登录至GenBank序列库.

2　结果

2.12014年华南地区PRRSV样品检测结果2014年,由华南地区不同养殖场疑似PRRSV样品中检测到的阳性样品中,按照采集地点和时间不同选取16株进行ORF5基因序列分析.

2.2PRRSV ORF5基因的同源性和遗传进化分析对16株序列ORF5氨基酸和核苷酸同源性分析结果表明,2014年毒株之间的ORF5的核苷酸同源性达到82.8%～100%,与参考序列比较发现这16株毒株与变异株JXA1,HuN4,TJ株,欧洲型代表株LV,北美型代表株VR2332,以及中国经典代表毒株CH-1a的ORF5核苷酸同源性分别在84.4%～99.3%,84.4%～99.5%,84.4%～99.3%,62.1%～64.5%,83.6%～89.2%,85.9%～95.0%范围.ORF5进化树分析结果表明,所有毒株均属于美洲型毒株,同时所分离毒株与参考毒株又进一步分为4个大的分支:分别为以JXA1为代表的高致病性毒株的亚群(第1亚群),以中国经典株CH-1a为代表的亚群(第3亚群),以美洲型疫苗株VR2332为代表的亚群(第4亚群),以及以2012年报道的GM2和QYYZ为代表的新分支亚群(第2亚群).本研究16株毒株中13株主要分布于以JXA1为代表的高致病性毒株亚群,剩下的3株(14ZS3,14ZS9和14DG)独立分布于以GM2,QYYZ为代表的新分支亚群,GM2和QYYZ为2012年报道的弱毒疫苗与野毒重组的新型重组毒株(图1).

2.3PRRSV ORF5氨基酸位点分析根据不同区域(包括信号肽区1-26aa,诱导表位(A/V) VLV,中和表位PNE,37H(F/L)QLIYNL45,高变区,转膜区,以及细胞表位)对ORF5氨基酸位点突变分析,发现不同亚型的毒株表现出不一样的突变情况,而第2亚群表现出最为广泛的突变,突变位点分布在信号肽区,高变区(aa32-40),诱导表位,中和表位以及细胞表位(图2).在第二亚群(疫苗和野毒重组亚群),出现广泛的突变位点,包括信号肽区(C10G,Y24C,L25S,A26I),诱导表位(V27A),HVR1(S32N,N33G,N35S),中和表位(H38Y,I39S),TM1(T66C),TM2(Y101F),T细胞表位(L117F,L152I,E161I),以及B细胞表位(L189V,R191K,R199H,L200P)均出现同一突变,其中在信号肽区(C10G,Y24C),HVR1(N35S),TM2(Y101F),T细胞表位(E161I),以及B细胞表位(L200P)出现与第4亚群(以VR2332疫苗株为代表的亚群)相同的突变位点.另外,不同亚群之间糖基化位点数也存在差异,第1亚群中,包括4个糖基化位点,而在第2亚群只有3个糖基化位点.

3　讨论

根据ORF5核苷酸同源性分析结果表明,2014年所测毒株ORF5的核苷酸序列同源性分别达到82.8%～100%,与JXA1的同源性最高,为84.4%～ 99.3%,初步表明2014年华南地区主要流行株与高致病性毒株具有较高的亲缘关系.进化树分析结果显示,16株毒株中的13株主要分布于以JXA1为代表的高致病性毒株亚群,剩下的3株独立分布于以GM2,QYYZ为代表的新分支亚群,GM2和QYYZ为2012年报道的弱毒疫苗与野毒重组的新型重组毒株.目前华南地区主要流行毒株为高致病性毒株,野毒重组的新型重组毒株的出现表明华南地区毒株亚型的多样性.在第2亚群中,GM2为2012年报道QYYZ与RespPRRSMLV疫苗株的重组株[3].有大量文章报道,在华南地区疫苗的大量使用可能会存在弱毒苗的毒力返强或者疫苗毒与野毒的重组现象,同时大量使用疫苗对病毒产生较强的免疫压力,加速病毒的进化趋势[3-5].此外,本实验室有研究17株全长序列分析表明潜在的疫苗株返强的可能[6].近年所报道的出现新的额外缺失毒株如BL2,QY2010,NVDC-GD2,GDQY2,GDQJ等毒株均分离于广东地区[7-10].

图1　基于PRRSV ORF5基因的遗传进化分析

图2　PRRSV GP5氨基酸位点变异性分析

第2亚群的ORF5氨基酸位点在不同区域均表现出大量的变异,其中信号肽区(C10G,Y24C),HVR1(N35S),TM2(Y101F),T细胞表位(E161I),以及B细胞表位(L200P)出现与第四亚型相同的突变位点,说明疫苗的广泛使用可能导致疫苗株的返强或者重组高变异株的暴发[11-13].有研究表明,R13Q和R151G是病毒弱化的标志,在第2亚群中的3个毒株中,14DG仅存在一个突变R13Q,14ZS3和14ZS9在该两个位置均有突变R13H和R151K,但该亚群中的毒株是否为强毒株还需进行进一步的监测[12].有研究表明,糖基化位点的增加会导致聚糖屏蔽作用,作为一种免疫逃避机制.第2亚群中仅存在的糖基化位点比第1亚群少,在缺乏糖链的保护作用且处在较高的免疫压力选择下,导致第2亚群的ORF5氨基酸不同区域的位点出现大量突变[14].

图3　PRRSV GP5氨基酸位点变异性分析

综合结果说明,华南地区大量高致病性毒株的存在,以及疫苗株与野毒株重组毒新亚群的出现充分表明,华南地区PRRSV流行毒株的多样性、高变异性以及复杂性.本研究结果为华南地区对于PRRSV的防控提供一定的参考.

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Genetic variation and phylogenetic analysis of ORF5 geneof PRRSV in Southern China in 2014

DENG Sheng-chao,FENG Jia-ping,CUI Jin,CHEN Yao,CUI Tian-tian,BAI Xiao-lei,SHI Qing-wei,ZHANG Gui-hong
(College of Veterinary Medicine,South China Agriculture University,Guangzhou 510642,China)

To analyze the genetic variation of PRRSV in South China,a total of 16 PRRSV positive samples were collected from different breeding farms in Southern China in 2014,and the ORF5 genes were amplified by RT-PCR,cloned and sequenced. The results of alignment analysis showed that all of the ORF5 of the 16 strains had 82.8%～100%nucleotide identity to each oth⁃er,and exhibited 84.4%～99.3%,85.9%～95.0%and 83.6%～89.2%homology with JXA1,Ch-1a and VR2332,respectively. Phylogenetic analysis based on the ORF5 gene indicated that 13 of 16 strains were closely related to the JXA1 strain and belonged to subgroup I,and the other 3 strains were closely related to the new branch of GM2 and QYYZ strains isolated in 2012 which be⁃longed to subgroup II.ORF5 phylogenic analysis revealed that the extensive mutations existed in this subgenotype of the new branch,especially in the signal peptide,induced epitopes,neutralizing epitopes,and hypervariable regions.

ZHANG Gui-hong

S852.65

A

0529-6005(2016)06-0003-04

2015-04-09

现代农业产业技术体系建设专项资金资助(CARS-36)

邓胜朝(1989-),男,硕士生,主要从事动物病毒分子生物学研究,E-mail:shengchaod@126.com

张桂红,E-mail:guihongzh@126.com