沈付娆,杨建乐,赵贵民,朱　彤,程凯慧,王洪梅,何洪彬

(1.山东省农业科学院奶牛研究中心,山东济南250100;2.山东师范大学生命科学学院,山东济南250000;3.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030)

牛冠状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

沈付娆1,2,杨建乐1,3,赵贵民1,朱彤1,程凯慧1,王洪梅1,何洪彬1

(1.山东省农业科学院奶牛研究中心,山东济南250100;2.山东师范大学生命科学学院,山东济南250000;3.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030)

针对牛冠状病毒(BCoV)N基因保守序列设计合成了1对特异性引物,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了检测BCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.在1个反应体系中模板最低检测限为7.8 copies/μL,比普通RT-PCR更加灵敏;与牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均无交叉反应;批内、批间重复变异系数均低于1.5%;应用定量PCR检测了39份疑似临床病料,阳性检出率为51.28%(20/39),普通RT-PCR为41.03%(16/39).结果表明,该方法特异性强、稳定性好、准确率高,本方法将为BCoV的临床诊断和流行病学调查提供技术保障.

牛冠状病毒;SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR;病毒核酸检测

牛冠状病毒(Bovine Coronavirus,BCoV)属冠状病毒科冠状病毒属2a亚群,为单股正链RNA病毒[1].由于病毒核衣壳蛋白N基因高度保守,常被用于BCoV的检测[2].BCoV是引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原[1].自1972年Mebus首次报道分离到BCoV[3],全世界很多国家和地区先后报道了BCoV的感染情况[4]. BCoV主要通过消化道和呼吸道传播,感染的牛长期带毒并在一定时期内持续排毒,易造成牛群的大范围感染[5].因此,对带毒牛的及时检出和牛场环境监测就显得尤为重要.

实时荧光定量PCR是一种在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程的核酸定性、定量分析技术,具有敏感性高、特异性强、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点[6],已成为病原微生物快速检测的重要方法.本研究针对BCoV高度保守的N基因序列设计引物,建立了BCoV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并初步应用于临床样本的检测.

1　材料与方法

1.1试验材料与试剂反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex Taq™II试剂盒,均购自宝生物工程(大连)有限公司.39份腹泻粪便样本采自多个规模化牛场的成母牛.

1.2引物的设计及阳性标准品的制备根据BCoV Mebus株(GenBank:U00735.2)N基因的保守区,利用Primer Express 3.0设计合成了3对引物,最终筛选出最佳引物对,即上游引物(P1):5′-TC⁃GTTCTGGTAATGGCATCCT-3′;下游引物(P2): 5′-AGTAGCAGTTTGCTTGGGTTGAG-3′,目的片段为100 bp.以BCoV的cDNA为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶回收后克隆至pEAST-T3载体,重组阳性质粒送上海华大基因科技服务有限公司测序,结果正确的重组质粒用核酸蛋白分析仪测得浓度为265 ng/μL.按照下面的公式转换成质粒的拷贝数:拷贝数=质粒浓度X10-9X6.02X1023/ (660X质粒总长度),计算出所获质粒的拷贝数为7.8X1010copies/μL.

1.3SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应体系的建立及优化以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增,其反应总体系为20 μL.设立引物终浓度梯度为0.1～1.0 mol/L,温度梯度为59℃～68℃,根据PCR扩增结果,以Ct最小值、荧光最高值、熔解曲线显示只有单特异峰为标准,对退火温度、引物浓度、循环条件进行优化.

1.4标准曲线的建立及敏感性、特异性和重复性试验以不同浓度质粒标准品为模板,采用优化好的条件进行荧光定量PCR扩增,得到各自的Ct值,绘制标准曲线.并比较荧光定量PCR和普通RT-PCR的敏感性.以BCoV、BRV、BVDV、IBRV、BEV、BEFV和BPIV3病毒的cDNA/DNA为模板(均为本实验室保存),验证本方法的特异性;用 DNA含量为7.8X103～7.8X106copies/μL的模板分别做3个批内重复和批间重复,评价其重复性.

1.5临床样品的检测用本研究建立的荧光定量PCR方法和RT-PCR分别对39份送检样本进行检测,将检测结果阳性的PCR产物送上海华大基因科技服务有限公司测序进行确认,最后对两种检测结果进行比较.

2　结果

2.1实时荧光定量PCR反应条件的确定SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应体系为20 μL:2X SYBR Premix Ex Taq II 10 μL,模板2 μL,上、下游引物各0.5 μL,ddH2O 7 μL.反应条件为预变性95℃30 s,95℃变性5 s、60℃退火延伸30 s,进行40个循环;熔解曲线为95℃5 s、62℃60 s、95℃Continuous;最后50℃30 s,结束反应.温度转换率为20℃/s,在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测.实时荧光定量PCR检测BCoV的扩增曲线见图1.

图1　SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的扩增曲线

2.2实时荧光定量PCR的标准曲线的建立以起始模板浓度的对数为横坐标,以循环中的Ct值为纵坐标,建立荧光定量标准曲线(图2),标准曲线的表达式为y=-3.2966x+38.697,相关系数R2值为0.9777,说明该方法线性关系良好.通过对熔解曲线分析(图3),可以发现标准样品均出现了窄且尖的单峰,而阴性对照没有出现熔点峰.表明该SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应为特异性扩增.份为BCoV感染阳性,阳性检出率为41.03%.所有阳性样本均通过PCR产物序列测定验证,结果证实为BCoV感染阳性.

图2　SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的标准曲线

图3　SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR溶解曲线

2.3特异性和敏感性试验用建立的荧光定量PCR方法对BCoV、BEV、BEFV、BVDV、IBRV、BRV和BPIV3进行检测,结果只是BCoV有荧光曲线(图4).经过检测,确定实时荧光定量PCR在20

图4　SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR特异性扩增曲线

表1　SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的重复性试验

3　讨论

目前BCoV的核酸检测被认为是一个较敏感和快速的诊断方法[7],先后有RT-PCR、Nested PCR、Semi-Nested PCR的研究报道[8-9].Nicola Decaro等应用TaqMan探针建立了BCoV荧光定量RT-PCR方法[10],相比较普通的RT-PCR,更加特异、灵敏,但是存在探针设计复杂、淬灭不彻底、成本高等不足.本研究以价格低廉的SYBR GreenⅠ染料代替探针,μL反应体系中的最低检出限为7.8 copies/μL (7.8X101copies/μLX2 μL/20 μL),而普通RT-PCR为7.8X102copies/μL(图5).表明SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR要比普通PCR有更高的敏感性.

图5　普通RT-PCR的敏感性检测

2.4重复性试验以4份不同浓度的质粒标准品为模板,分别做批内、批间重复,通过计算Ct值的标准差(SD)和变异系数(CV)来验证荧光定量PCR的重复性.变异系数均小于1.5%,重复性良好,见表1.

2.5临床检测结果通过对39份临床样品进行检测,荧光定量PCR检测出20份BCoV感染阳性,阳性检出率为51.28%,而普通RT-PCR仅检出16建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,可以用于牛冠状病毒病的实验室早期诊断.

BCoV引起的犊牛感染多为1～90日龄,腹泻常发生于1～2周龄内,这一时期犊牛血清抗体反映的是从初乳中获得的母源抗体水平.用普通RT-PCR和荧光定量PCR方法检测病毒核酸,不受母源抗体的影响.在对39份临床样品的检测中,SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测到20份阳性,而普通RT-PCR检测到16份阳性,说明该荧光定量方法相对于普通RT-PCR方法的阳性检出率提高了10.25%.这证明荧光定量PCR比普通RT-PCR更敏感.

总之,本研究建立的牛冠状病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法特异、敏感、稳定、高效.每次反应96个样本可同时进行,试验结束后不需要凝胶电泳,从样本处理到报告结果得出仅需3 h.可以满足对大规模暴发的疫情做出快速准确的诊断.这对于下一步开展BCoV流行病学调查、临床病例的快速诊断乃至疫病的防控等方面会起到重要作用.

[1]Saif L J.Bovine respiratory coronavirus[J].Vet Clin North Am Food Anim Pract,2010,26(2):349-364.

[2]Cho K O,Hasoksuz M,Nielsen P R,et al.Cross-protection stud⁃ies between respiratory and calf diarrhea and winter dysentery coronavirusstrains in calves and RT-PCR and nested PCR for their detection[J].Arch Virol,2001,146(12):2401-2419.

[3]Mebus C A,Stair E L,Rhodes M B,et al.Pathology of neonatal calf diarrhea induced by a coronavirus-like agent[J].Vet Pathol,1973,10(1):45-64.

[4]Hansa A,Rai R B,Dhama K,et al.Isolation of bovine coronavi⁃rus(bcoV)in vero cell line and its confirmation by direct FAT and RT-PCR[J].Pak J Biol Sci,2013,16(21):1342-1347.

[5]刘振格.BCoV DQ株弱毒株的培育及其对BALB/c小鼠免疫效果研究[D].大庆:黑龙江八一农垦大学,2013.

[6]袁亚男,刘文忠.实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用[J].中国畜牧兽医,2008,35(3):27-30.

[7]Mackay I M.Real-time PCR in the microbiology laboratory[J]. Clin Microbiol Infect,2004,10:190-212.

[8]Cho K O,Hasoksuz M,Nielsen P R,et al.Cross-protection stud⁃ies between respiratory and calf diarrhea and winter dysentery coronavirus strains in calves and RT-PCR and nested PCR for their detection[J].Arch Virol,2001,146(12):2401-2419.

[9]Takiuchi E,Stipp D T,Alfieri A F,et al.Improved detection of bovine coronavirus N gene in faeces of calves infected naturally by a semi-nested PCR assay and an internal control[J].J Virol Methods,2006,131(2):148-154.

[10]Decaro N,Elia G,Campolo M,et al.Detection of bovine coronavi⁃rus using a TaqMan-based real-time RT-PCR assay[J].J Virol Methods,2008,151(2):167-171.

Development and preliminary application of a SYBR GreenⅠReal-timePCR assay for detection of bovinecoronavirus

SHEN Fu-rao1,2,YANG Jian-le1,3,ZHAO Gui-min1,ZHU Tong1,CHENG Kai-hui1,WANG Hong-mei1,HE Hong-bin1
(1.Research Center of Dairy Cattle,Shandong Academy of Agricultural Science,Jinan 250100,China;2.College of Life Science,Shandong Normal University,Jinan 250000,China;3.Northeast Agricultural University college of life science,Harbin 150030,China)

In order to detect bovine coronavirus(BCoV),we developed a SYBR GreenⅠreal-time PCR assay.According to the sequence of bovine coronavirus N gene,a pair of primers was designed.The cDNA was prepared by in vitro transcription and used as standard positive template.Then,the SYBR GreenⅠreal-time fluorescence quantitative RT-PCR assay was established to detect BCoV.The developed SYBR GreenⅠreal-time fluorescence quantitative RT-PCR was much more sensitive than the conven⁃tional RT-PCR and could detect the template as low as 7.8 copies/μL.There were no cross reactions with the other digestive and respiratory pathogens from cattle.The Inter-and intra-assays were conducted using the standard plasmid and the coefficients of variation were less than 1.5%.The 39 suspected samples were detected both by SYBR GreenⅠreal-time RT-PCR,and gel-based RT-PCR,and the positive detection rate were 51.28%and 41.03%,respectively.The SYBR GreenⅠreal-time PCR assay was much more specific,sensitive,rapid and accurate and could be used as an effective tool for clinical diagnosis,epidemiological in⁃vestigation and quantification of bovine coronavirus.

BCoV;SYBR Green I Real-time PCR;Virus Detection

HE Hong-bin

S852.65+3

A

0529-6005(2016)06-0022-03

2014-12-31

现代农业(奶牛)产业技术体系科学家岗位(Cars-37);泰山学者海外特聘专家(tshw20100417);国家自然科学基金(31272586;31302095);山东省农业重大应用技术创新课题,兽医生物技术国家重点实验室开放课题基金(SKLVBF201510);山东省农业科学院科技创新重点项目(2014CXZ08)子课题(2014CXZ-08-3);山东省农业科学院重大成果培育项目(2015CGPY02)

沈付娆(1989-),女,硕士生,从事免疫细胞生物学研究,E-mail:FuraoS@126.com

何洪彬,E-mail:hongbinh@hotmail