秦生巨

（南京巨豹生物工程有限公司）

噬菌蛭弧菌分子生物学特性的研究（八）

秦生巨

（南京巨豹生物工程有限公司）

秦生巨老师从1979年开始研究“噬菌蛭弧菌、弧菌噬菌体为主的微生物生态制剂”，至今已经30多年，是我国噬菌蛭弧菌、弧菌噬菌体及其微生物生态制剂研究的创始人。

5.4.3.4 蛭弧菌的成熟与分裂：

当蛭弧菌进入宿主细胞之后，进行了一系列的生理形态变化：鞭毛消失；菌体延长。当蛭弧菌在宿主中生长后期，菌体成熟，鞭毛重新形成，多个子代蛭弧菌形成。

Ruby等到、将蛭弧菌小体用EDTA（乙二胺四乙酸）及菌体裂解酶处理，使蛭弧菌释放。当蛭弧菌释放时，所有的DNA合成停止，分化成具有侵染力的子代蛭弧菌。蛭弧菌在侵入宿主后约60min，由起动信号开始其DNA合成，在每个DNA合成周期结束后，由宿主菌的另一信号启动第二轮DNA合成。子代蛭弧菌DNA合成后，随着其它大分子的合成，装配分化成多个子代蛭弧菌细胞。研究中发现，生长期的蛭弧菌具有很强的适应性，在任何时候都可以分化，不需要外源性的碳源和能源，完全是依赖蛭弧菌自身。蛭弧菌正常的周质生长期是在其“调节”物质耗尽时开始的。

5.5 宿主细胞的裂解

蛭弧菌对宿主细胞的裂解特性，长时间以来，一直被人们关注。对蛭弧菌的裂解机制也进行了大量的研究工作。1978年Thomashow等提出的“蛭弧菌穿入、稳定、裂解”模型较有代表性。参与这一过程的主要酶包括：聚糖酶，蛋白酶，N-脱酰基酶、酰基转移酶，Braun去脂蛋白酶（可能是蛋白酶），裂解经修饰的肽糖酶，脂酶，溶菌酶等。

聚糖酶及脂蛋白酶只是在蛭弧菌“穿入”时有活性，而蛋白酶在蛭弧菌的大部分生活期间有活性，但活力不断下降。这三种酶在蛭弧菌“钻孔”中起了作用。N-脱酰基酶、酰基转移酶的作用是维持蛭弧菌小体的稳定，能使之抗渗透压，不被破坏。去Braun脂蛋白酶主要是通过修饰底物细胞壁，使聚糖酶作用消失，而完成这一功能。当蛭弧菌在周质中生长时成熟后，蛭弧菌合成一种新的酶，其功能是完全裂解修饰的肽聚糖，其作用位点于肽聚糖中不可缺少的氨基糖连接键。从而释放子代蛭弧菌。

6 蛭弧菌突变菌株的研究

早期研究认为，蛭弧菌是胞内寄生物。1975年Starr指出，蛭弧菌与宿主细胞不仅仅是寄生的关系，而且还存在共同生的关系。并且发现蛭弧菌存在依赖于宿主菌生长和非依赖宿主菌生长的两种菌株。因此，蛭弧菌可被认为有“依赖共生（S-D）”及“非依赖共生（S-C）”或“非依赖共生条件突变株（Sd-comp+）”两种。非依赖共生条件突变株最早于1963年分离得到，称为“非依赖宿主”菌。然而，这些命名均不能准确描述蛭弧菌突变株的性质。因为一株“非依赖宿主菌”蛭弧菌可以在无宿主菌细胞的培养基中生长，并不意味着它本身不具备在宿主细胞中生长的能力。Varon蛭弧菌突变株新命名方式，把它们分为：①Sincomp+，具有兼性生长特性突变株；②Sin comp-，非共生性突变株；③Sd comp-，条件性突变株，在合适的温度环境中，可以不依赖于宿主生长，但在限制温度的环境中，只能在宿主菌细胞内生长。蛭弧菌突变株Bd109J研究表明，从Sd comp+中分离出的Sin突变株大多数为comp+，从Sincomp-中分离到comp-。Sincomp+在有机培养基中对Sincomp+的选择不利，在含有大肠杆菌的缓冲液中对Sd comp-的选择不利。

Junn等对温度敏感的蛭弧菌Bd109D突变株进行了研究，这些突变株通过乙基甲烷磺酸诱变剂处理而获得，回复突变率为10-6-10-9。通过电境、温度漂移、一步生长试验、吸附动力及大分子通透性等研究，发现其生活周质中的许多途径被中断。如蛭弧菌Bd109D153推动吸附能力，Bd109D3和Bd109D48不能穿入宿主细胞，Bd109D4和Bd109D152推动在细胞内生长的能力。在限制温度下，Bd109D153尽管仍然高速运转，但对宿主细胞的吸附受到抑制。在38.5℃时,蛭弧菌Bd109D153吸附于大肠杆菌宿主细胞壁,同其野生菌株吸附在枯草杆菌（革兰阳性菌,非特异性宿主细胞）上一样,随后不穿入细胞,从其吸附的细胞上脱落.揭示蛭弧菌有早期阶段,存在“两期吸附”的现象。

目前所知，野生菌株几乎都在宿主细胞内生存的。但对其衍生菌株（兼性及不依赖于宿主细胞）的研究，特别是对其突变株的研究用于描述蛭弧菌代谢机制是具有重要的意义和指导实践价值的。（未完待续）