方　明，张荣新，朱金海



·基础医学·

程序性死亡4基因在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

方明1，张荣新2，朱金海3

目的：通过测定食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)患者肿瘤组织中程序性死亡4基因(Pdcd4)的表达，探讨Pdcd4与食管鳞癌发生、发展的关系。方法：应用实时荧光定量聚合酶链反应检测60例食管鳞癌组织中Pdcd4 mRNA的表达情况，同时应用免疫组织化学法检测石蜡包埋的178例食管鳞癌组织中Pdcd4的表达水平，相应的癌旁正常组织作为对照。结果：Pdcd4 mRNA在食管鳞癌组织中的表达量显著低于癌旁正常组织(P<0.01)。Pdcd4在癌旁正常组织中的阳性表达率为100.0%，明显高于食管鳞癌组织中的47.2%(P<0.01)。Pdcd4的表达与肿瘤的分化程度有关，在高分化食管鳞癌的阳性率为71.4%，中分化食管鳞癌的阳性率为43.4%，低分化食管鳞癌的阳性率为30.2%，高分化鳞癌中Pdcd4阳性率高于中分化及低分化癌(P<0.01)；中、低分化食管鳞癌中Pdcd4阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)；Pdcd4阳性率在患者的年龄、肿瘤大小、TNM分期和N分期间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论：Pdcd4异常表达与食管鳞癌的组织病理分级有关。

食管肿瘤；程序性死亡4基因；免疫组织化学；实时荧光定量聚合酶链反应

程序性死亡4基因(Pdcd4)作为控制细胞凋亡的重要因子,是SHIBAHARA等[1]首先在小鼠体内克隆到的MA-3基因，该小鼠基因长约21 kb,有11个外显子，为单拷贝。人类Pdcd4基因定位于染色体10q24,相对分子质量约64 000,蛋白序列编码485个氨基酸[2]，含有表示氨基端和羧基端核定位信号的基本区域。Pdcd4不仅影响了细胞程序性死亡，而且通过抑制蛋白翻译的起始因子抑制肿瘤的发生、发展。Pdcd4在食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)中表达明显下调或缺失，并且与肿瘤的分化程度、肿瘤大小、浸润深度、淋巴道转移、血道转移相关。本研究选用食管鳞癌标本作为研究对象，通过聚合酶链反应(PCR)及免疫组织化学法分别从mRNA和蛋白水平上检测Pdcd4在食管鳞癌组织中的表达水平，探讨Pdcd4基因在食管鳞癌发生、发展过程中的作用。现作报道。

1　材料与方法

1.1一般资料选取蚌埠医学院第一附属医院2011年10月至2012年6月肿瘤外科手术切除新鲜食管鳞癌组织标本60例；其中男36例，女24例；年龄46～79岁；均经术后病理证实为食管鳞癌，术前均未接受放、化疗；相应的癌旁正常组织作为对照。所有标本在离体30 min内经液氮速冻后置入经去酶处理的冻存管中，并放入-80 ℃冰箱中冻存备用。同时从蚌埠医学院第一附属医院临床病理科收集2010年1月至2010年6月178例石蜡包埋的食管鳞癌组织；其中男103例，女75例；年龄48～82岁；相应癌旁正常组织作为对照。

1.2主要试剂免疫组织化学EliVision法检测Pdcd4的表达，试剂兔抗人Pdcd4 Ab和抗兔二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；抗体稀释液胎牛血清由蚌埠医学院病理实验室提供，液体DAB酶底物显色试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，无水乙醇、二甲苯、PBS缓冲液、抗原修复液0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH 6.0，枸橼酸三钠3 g，枸橼酸0.4 g)由蚌埠医学院病理实验室提供。Trizol(RNA提取试剂)和PCR试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司进行，Pdcd4引物设计由上海生工生物工程技术服务有限公司进行；SyBR、Dye、溴酚蓝、琼脂糖、溴化乙锭(EB)购自上海生工生物工程技术服务有限公司；焦炭酸二乙酯(DEPC)、三氯甲烷、异丙醇、乙醇去RNA酶水、超纯水由蚌埠医学院病理实验室提供。

1.3方法

1.3.1PCR方法采用在线Primer3引物设计软件设计SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR扩增Pdcd4引物序列,上游引物：5′ AAA GGG AAG GTT GCT GGA TAG 3′，下游引物：5′ CAC ATC CAC CTC CTC CAC AT 3′，扩增产物长度130 bp。内参GAPDH 引物序列，上游引物：5′ TGG GTG TGA ACC ATG AGA AGT 3′，下游引物：5′ TGA GTC CTT CCA CGA TAC CAA 3′，扩增产物长度1 126 bp。

采用Trizol法提取食管鳞癌组织和癌旁正常组织RNA，经紫外分光光度计测定并采用2.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA质量。按逆转录试剂盒说明书合成cDNA，逆转录的cDNA用于PCR反应；反应条件：预变性 95 ℃ 2 min，变性95 ℃ 10 s，退火/延伸60 ℃ 40 s，共40个循环；扩增完毕后进行融解曲线分析，并观察其是否为单峰曲线。根据标准品的扩增情况绘制标准曲线，检测扩增效率。PCR结果表示：以GAPDH为内参基因，用在食管鳞癌组织及癌旁正常组织中的CT值与GAPDH的CT值相减，求出ΔCT值，目的基因Pdcd4的表达量=2-△△CT，比较Pdcd4 mRNA在食管鳞癌组织与癌旁正常食管组织中表达的差异。

1.3.2免疫组织化学方法按试剂盒说明操作。根据着色程度和阳性细胞总数判定，Pdcd4蛋白在正常食管组织中大多数以细胞核中呈不同染色程度的棕黄色颗粒为特点，少数位于细胞质，而在食管癌组织中细胞核着色明显下降并有向细胞质中转移的倾向。每张切片随机观察10个高倍视野(×400)，每个高倍视野计数100个癌细胞，计阳性细胞百分数。没有或<30%的阳性细胞记为阴性；≥30%记为阳性[3]。

1.4统计学方法采用χ2检验及配对t检验及秩和检验。

2　结果

2.1食管正常组织和鳞癌组织Pdcd4相对定量结果比较癌旁正常组织中的Pdcd4 mRNA含量明显高于食管鳞癌组织中的含量(P<0.01)(见表1)。

2.2免疫组织化学结果比较178例癌旁正常组织Pdcd4阳性率为100.0%；Pdcd4在食管鳞癌组织中表达较少，阳性率为47.2%。Pdcd4在癌旁组织中的阳性率显著高于食管鳞癌组织(P<0.01)(见表2，图1、2)。在食管鳞癌组织中，高分化鳞癌中Pdcd4阳性率均明显高于中分化和低分化鳞癌(P<0.01)(见表3，图3、4)。Pdcd4阳性率在患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期和N分期间差异均无统计学意义(P>0.05) (见表4)。

表2食管鳞癌和癌旁正常组织Pdcd4免疫组织化学结果比较(n)

表3　食管鳞癌组织病理分级与Pdcd4表达的关系

率的两两比较：与高分化比较**P<0.01

表4　食管鳞癌临床病理特征与Pdcd4表达的关系

*示Hc值

3　讨论

细胞凋亡是维持细胞生理性过程和机体稳定的重要形式。Pdcd4是近年来发现的一种肿瘤抑制因子，可与真核细胞翻译起始复合物中的翻译起始因子A(eIF4A)相互作用，通过eIF4A的解螺旋酶活性并且与eIF4G结合，从而抑制与细胞增殖有关的转录因子合成[4]。近年来有学者[5-6]认为Pdcd4对肿瘤的抑制作用主要通过抑制肿瘤细胞转录和翻译过程而实现。

食管癌作为危害人类健康较为严重的恶性肿瘤，其发生是多基因、多阶段、多因素共同参与下的复杂过程，其中包括癌基因的激活和抑癌基因的下调和灭活，以及细胞凋亡和增殖调节失控等。本实验应用免疫组织化学法检测石蜡包埋的178例食管鳞癌组织和相应的178例癌旁正常组织中Pdcd4的表达水平，结果显示Pdcd4在癌旁正常组织中的阳性率为100.0%，明显高于食管鳞癌组织中的47.2%，这与FASSAN等[7]的相关研究基本一致，提示Pdcd4对食管鳞癌的发生有一定影响。WEDEKEN等[8]对Pdcd4是通过何种通道及机制影响食管鳞癌发生作了相应研究，提示Pdcd4基因通过该5′端的非编码区功能域与真核细胞翻译起始因子eIF4A发生结合，通过封闭eIF4A解螺旋酶活性从而抑制p53 mRNA以及核糖体复合物和蛋白质的合成，达到抑制细胞的生长和转化的目的。microRNA-21在肿瘤中的作用近年来被逐渐公认，microRNA-21是通过Pdcd4靶基因而起作用[9]，microRNA-499-5p通过Pdcd4靶基因而起作用影响结直肠癌的发生和转移[10]。因此我们认为Pdcd4在食管组织中的水平对肿瘤的发生起一定的作用，低水平的Pdcd4促使肿瘤的形成，而高水平的Pdcd4有预防肿瘤的作用。

肿瘤临床分期不仅可以指导临床治疗而且是影响肿瘤预后的重要因素。本实验发现Pdcd4在食管鳞癌临床TNM分期中表达差异无统计学意义(P>0.05)，与FASSAN等[7]的研究结果相反，究其原因可能与临床病例分期选择差异有关。本研究通过免疫组织化学法检测不同病理分化程度食管鳞癌组织中Pdcd4的表达，结果提示高分化鳞癌中Pdcd4的表达均高于中分化及低分化癌(P<0.01)；但中、低分化食管鳞癌中Pdcd4的差异无统计学意义，与FASSAN等[7]的结果不一致，这可能与分级标准选择的差异以及东西方人基因表达差异有关。

SIEWERT等[11]分析认为，肿瘤细胞分化程度是食管癌淋巴结转移的一个独立影响因子，肿瘤细胞的分化程度越低，其淋巴结转移率越高。淋巴结转移是影响食管鳞癌预后的重要因素，新分期对N分级的改变体现在将原先的有无淋巴结转移根据淋巴结转移数目细化为N0～N34个等级，临床研究[12]表明淋巴结转移数目与食管鳞癌生存期呈负相关。本研究发现食管鳞癌N0、N1、N2、N3中Pdcd4蛋白的表达差异无统计学意义(P>0.05)，与FASSAN等[7]的结果有差异，这可能与新的食管鳞癌分期中N分级的变化有关，新分期中只是注重淋巴结转移数目而没有区分淋巴结转移部位及频度；也有可能与东西方人基因表达差异有关。

综上，我们的实验证明Pdcd4在食管鳞癌发生中的作用是肯定的，并且在不同分化程度肿瘤中表达存在差异。至于在肿瘤不同分期中的表达差异目前国内外的研究尚无共识，仍有大量的研究及工作要做。

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[8]WEDEKEN L,SINGH P,KLEMPNAUER KH.Tumor suppressor protein Pdcd4 inhibits translation of p53 mRNA [J].Biol Chem，2011，286(50):42855.

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(本文编辑刘梦楠)

Expression of programmed cell death 4 gene in esophageal squamous cell carcinoma and its significance

FANG Ming1,ZHANG Rong-xin2,ZHU Jin-hai3

(1.DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstPeople′sHospitalofWuhu,WuhuAnhui241000;2.DepartmentofSurgicalOncology,AnhuiProvincialTumorHospital,HefeiAnhui230000;3.DepartmentofSurgicalOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,BengbuAnhui233004,China)

Objective:To explore the expression of programmed cell death 4(Pdcd4) gene in esophageal squamous cell carcinoma,and relationship between the expression level of Pdcd4 and occurrence and development of tumor.Methods:The expressions of Pdcd4 mRNA in 60 esophageal squamous cell carcinoma tissues and adjacent normal tissue were detected by real-time polymerase chain reaction,and the expressions of Pdcd4 protein in 178 esophageal squamous cell carcinoma tissues and adjacent normal tissue were detected by immunohistochemical method.Results:The expression of Pdcd4 mRNA in esophageal squamous cell carcinoma tissue were significantly lower than that in adjacent normal tissue(P<0.01).The positive expression rate of Pdcd4 in esophageal squamous cell carcinoma tissue(47.2%) were significantly lower than that in adjacent normal tissue(100.0%)(P<0.01).The expression of Pdcd4 was correlation with tumor differentiation,the positive expression rates of Pdcd4 in high,moderate and low differentiation esophageal squamous cell carcinoma tissue were 71.4%,43.4% and 30.2%,respectively.The positive expression rate of Pdcd4 in high differentiation esophageal squamous cell carcinoma tissue was higher than that in moderate and low differentiation esophageal squamous cell carcinoma tissue,the difference of the positive expression rate of Pdcd4 between moderate and low differentiation esophageal squamous cell carcinoma was not statistically significant(P>0.05).The difference of the positive expression rate of Pdcd4 between age of patient,tumor size,TNM staging and N staging were not statistically significant(P>0.05).Conclusions:The abnormal expression of Pdcd4 is correlation with the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma.

esophageal neoplasms;programmed cell death 4;immunohistochemical;real time polymerase chain reaction

2014-08-14

单位] 1.安徽省芜湖市第一人民医院 普外科，241000；2.安徽省肿瘤医院 肿瘤外科，安徽 合肥 230000；3.蚌埠医学院第一附属医院 肿瘤外科，安徽 蚌埠 233004

[作者简介] 方明(1979-)，男，硕士，主治医师.

张荣新，硕士研究生导师，主任医师，教授.E-mail：zrx13855219010@126.com

1000-2200(2016)05-0570-04

R 735.1

A

10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.05.004