孙凌聪，张华勋，裴速建，夏　菁，吴冬妮，林　文

(湖北省疾病预防控制中心寄生虫病防治研究所，武汉 430079)



湖北省首例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的病原学诊断分析

孙凌聪，张华勋△，裴速建，夏菁，吴冬妮，林文

(湖北省疾病预防控制中心寄生虫病防治研究所，武汉 430079)

摘要:目的应用巢式PCR技术对1例罕见卵形疟原虫wallikeri亚种进行诊断和鉴定。 方法采集初诊为输入性间日疟患者血样，进行疟疾快速诊断试剂盒、显微镜镜检和巢式PCR检测，并进行测序分析。 结果该患者疟疾快速诊断试剂盒检测阴性；镜检查见寄生于红细胞内的疟原虫环状体和滋养体；采用卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物(rOVA1v/rOVA2v)进行巢式PCR，在760 bp处有特异性扩增条带，测序后经Blast比对，与GenBank数据库中卵形疟原虫wallikeri亚种部分序列的一致性为99%。 结论该患者经巢式PCR和序列分析确诊为湖北省首例卵形疟原虫wallikeri亚种感染。

关键词:输入性疟疾；卵形疟原虫wallikeri亚种；巢式聚合酶链反应

卵形疟原虫(Plasmodium ovale)于1922年首次由Stephens描述并因其在红细胞内的卵圆形态而被命名[1]。其主要分布于非洲，尤其是西非及东南亚国家。最近研究发现，卵形疟除经典亚种(Plasmodium ovale curtisi)外还存在另一变异亚种(Plasmodium ovale wallikeri)，两者无法通过镜检从形态上区分[2]。湖北省历史上未见卵形疟本地病例报道，但随着境外劳务输出的日益频繁，输入性卵形疟呈较大幅度增加，但未见wallikeri亚种报道[3]。本研究对湖北省1例初诊为输入性间日疟病例，采用巢式PCR鉴定，并进行测序分析，结果报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料患者男，31岁，荆门人，2013年11月赴非洲加纳从事野外金矿开采，务工期间曾多次感染疟疾(感染虫种不详)，均采用注射1～2 d抗疟药治疗，2014年8月回国约6个月后，出现发热、寒战、全身酸痛等症状，经县人民医院采血制片镜检诊断为间日疟，后经市级疾控中心镜检复核为输入性间日疟。采集该患者EDTA-Na2抗凝全血送省级疾控中心复核。

1.2仪器与试剂全血DNA 抽提试剂盒(QIAamp DNA Mini Kit)购自QIAGEN公司，DNA聚合酶(PrimeSTAR®HS DNA Polymerase)购自Takara公司，PCR预混反应体系(DreamTaq PCR Master Mix)购自Fermentas公司，疟疾快速诊断试剂盒(Malaria rapid diagnostic tests，RDTs)购自广州万孚生物技术有限公司。显微照相系统购自Leica公司，PCR扩增仪和电泳仪购自Bio-Rad公司，凝胶成像系统购自Ultra-Violet公司。

1.3方法

1.3.1RDTs检测取5 μL患者抗凝血，参照RDTs说明书进行检测。

1.3.2血涂片显微镜镜检取患者抗凝血制作有厚、薄血膜的血涂片，干燥、固定后采用Giemsa染色，油镜(×1 000)下镜检疟原虫。

1.3.3巢式PCR检测小亚基核糖体RNA(SSU rRNA)(1)参照文献[4-5]设计疟原虫属特异性引物rPLU5/rPLU6和间日疟、恶性疟、三日疟、卵形疟curtisi亚种和卵形疟wallikeri亚种5种疟原虫的种特异引物(分别为rVIV1/rVIV2、rFAL1/rFAL2、rMAL1/rMAL2、rOVA1/rOVA2和rOVA1v/rOVA2v)。由宝生物工程(大连)有限公司合成，见表1。(2)DNA提取参照QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取全血DNA，-20 ℃保存。(3)SSU rRNA第一轮扩增：20 μL反应体系中包含3 μL模板DNA，0.2 μL Taq DNA聚合酶，1.1 μL 6 μmol/L属特异性引物，1.6 μL 2.5 mmol/L dNTPs，4.0 μL 5×Buffer和9.0 μL水；反应条件为94℃变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共扩增35个循环；72 ℃延伸5 min。SSU rRNA第二轮扩增：20 μL反应体系中包含第一轮扩增产物2 μL，4对种特异性引物上、下游引物各1.0、10 μL 2×DreamTaq PCR Master Mix和补水至20 μL；扩增条件与第一轮扩增相同。(4)琼脂糖凝胶电泳：取2.0 μL 6×上样缓冲液与10 μL第二轮PCR扩增产物混匀，取6 μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳(90 V电泳40 min)，凝胶成像系统观察。(5)测序分析：将第二轮扩增产物送生工生物(上海)股份有限公司进行测序，测序结果在NCBI上进行Blast同源性分析。

表1　　基于SSU rRNA基因的疟原虫巢式PCR扩增体系

2结果

2.1RDTs检测结果患者抗凝血样经RDTs检测，结果为疟原虫阴性。

2.2血涂片显微镜镜检结果血涂片镜检厚血膜查见环状体和大滋养体；薄血膜中，被寄生的红细胞大小正常或略缩小，环状体和早期滋养体核较大，胞质较厚，大滋养体呈圆形，细胞质坚实，空泡不显著(图1)。

注：A为厚血膜中的环状体和大滋养体；B～D均为薄血膜，其中B为环状体，C为早期滋养体，D为大滋养体。

图1血涂片中的疟原虫(Giemsa染色，×1 000)

注：M为DNA标志物；NP-1993为采用NP-1993 PCR体系；Pow为采用卵形疟wallikeri亚种引物；1为空白对照；2为阴性对照；3～6分别为间日疟、恶性疟、三日疟和卵形疟curtisi亚种阳性对照；7、8为患者标本。

图2全血DNA巢式PCR检测结果

2.3巢式PCR检测结果采用NP-1933体系，患者样本扩增阴性；而以rOVA1v/rOVA2v为引物PCR扩增出大小约760 bp的特异性条带(图2)。

2.4扩增片段的序列分析结果扩增产物经测序，长度约为754 bp，采用NCBI中Blast程序对扩增序列(通过Bankit提交NCBI，GenBank登录号为KU315239)进行同源性比对，与GenBank中Plasmodium ovale wallikeri克隆GC-1 18S rRNA基因全序列(GenBank登录号KF696359.1)及卵形疟SUU rRNA基因(GenBank登录号AJ001527.1)一致性均为99%。

3讨论

卵形疟每年在非洲引起超过1 500万病例，由于其形态与间日疟相似和隔日发作特点，常被误诊为间日疟或三日疟而导致其感染率被低估[6]。而目前被基层广泛使用的RDTs产品对卵形疟、三日疟的诊断敏感性显著低于间日疟和恶性疟，卵形疟假阴性时常发生[7]。湖北省近几年才陆续有输入性卵形疟报道，基层医疗单位对卵形疟认识不足，从而导致本例患者误诊为间日疟。同时，卵形疟与间日疟一样，有肝细胞期休眠子的存在，可导致复发[8]。本研究中的患者回国6个多月才发病，如遇适当的传播媒介，引起输入性疟疾在本地传播的风险较大。此外，虽然卵形疟在其流行地区很少引起人类严重疾病，但可在外来人群中引起严重的临床疾病[9]。因此，加强基层医疗单位对卵形疟的认识和诊断能力，对防止漏诊和重症病例发生非常重要。

卵形疟原虫两个亚种形态上无法区分，仅潜伏期长短和潜在临床症状有所区别[10]，只有通过分子生物学方法才能区分。按照中国消除疟疾行动计划和疟疾诊断参比实验室的相关文件要求，各省应对每个疟疾病例按照国家疟疾比实验室推荐的巢式PCR方法(NP-1993体系[4])进行基因检测以明确感染虫种[11]。但研究发现，自wallikeri亚种被发现并正式命名后，传统的NP-1993体系仅对curtisi亚种敏感[12]。随后针对新亚种卵形疟的诊断技术和方法也不断更新，并取得了很多成果[3]。本研究中患者采用NP-1993体系进行巢式PCR检测阴性后，采用Calderaro等[5]报道的卵形疟原虫wallikeri亚种特异性引物(rOVA1v/rOVA2v)，扩增出特异性条带。扩增产物测序后在NCBI上进行同源性比对，确诊为卵形疟wallikeri亚种。

随着中国前往非洲、东南亚等地区务工人员不断增多，我国输入性疟疾疫情逐年上升，一些国内较为少见的疟疾类型，如三日疟、卵形疟及诺氏疟原虫。也不断增多[11]。湖北省2013年后已无本地疟疾病例报告，但随着输入性疟疾不断增多，卵形疟病例显著增加[4]。因此，加强基层医疗单位对少见疟疾种类的培训，并在传统镜检、RDTs方法基础上，结合PCR等分子生物学诊断技术，对降低少见输入性疟疾病例的漏诊、误诊，减少重症病例发生及防止输入性疟疾在本地传播，巩固消除疟疾的成果有重要意义。

参考文献

[1]Stephens JWW.A new Malaria parasite of man[J].Proceedings of the Royal Society of London,2016,87(596):375-377.

[2]Fuehrer HP,Noedl H.Recent advances in detection of Plasmodium ovale:implications of separation into the two species Plasmodium ovale wallikeri and Plasmodium ovale curtisi[J].J Clin Microbiol,2014,52(2):387-391.

[3]黄光全，胡乐群，张华勋，等．湖北省输入性疟疾发病态势及防控措施分析[J]．中国热带医学，2013，13(12)：1490-1493．

[4]Snounou G,Viriyakosol S,Zhu XP,et al.High sensitivity of detection of human malaria parasites by the use of nested polymerase chain reaction[J].Mol Biochem Parasitol,1993,61(2):315-320.

[5]Calderaro A,Piccolo G,Perandin F,et al.Genetic polymorphisms influence Plasmodium ovale PCR detection accuracy[J].J Clin Microbiol,2007,45(5):1624-1627.

[6]Sutherland CJ,Tanomsing N,Nolder D,et al.Two nonrecombining sympatric forms of the human malaria parasite Plasmodium ovale occur globally[J].J Infect Dis,2010,201(10):1544-1550.

[7]De Laval F,Oliver M,Rapp C,et al.The challenge of diagnosing Plasmodium ovale malaria in travellers:report of six clustered cases in French soldiers returning from West Africa[J].Malar J,2010,9:358.

[8]Tordrup D,Virenfeldt J,Andersen FF,et al.Variant plasmodium ovale isolated from a patient infected in Ghana[J].Malar J,2011,10:15.

[9]De Laval F,Simon F,Bogreau H,et al.Emergence of plasmodium ovale malaria among the French armed forces in the republic of Ivory Coast:20 years of clinical and biological experience[J].Clin Infect Dis,2014,58(8):122-128.

[10]Rojo-Marcos G,Rubio-Muoz JM,Ramírez-Olivencia G,et al.Comparison of imported Plasmodium ovale curtisi and P.ovale wallikeri infections among patients in Spain,2005-2011[J].Emerg Infect Dis,2014,20(3):409-416.

[11]李美，夏志贵，汤林华．卵形疟原虫wallikeri亚种及其基因检测体系的研究进展[J]．中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2014，32(1)：64-67．

[12]Fuehrer HP,Habler VE,Fally MA,et al.Plasmodium ovale in Bangladesh:genetic diversity and the first known evidence of the sympatric distribution of Plasmodium ovale curtisi and Plasmodium ovale wallikeri in southern Asia[J].Int J Parasitol,2012,42(7):693-699.

作者简介：孙凌聪，男，主管检验技师，主要从事寄生虫病检测、防治与研究。 △通讯作者，E-mail：530777955@qq.com。

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.14.022

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)14-1956-03

(收稿日期：2016-01-17修回日期：2016-03-20)

Analysis on etiological diagnosis of first case of imported Plasmodium ovale wallikeri subspecies in Hubei Province

SUNLingcong,ZHANGHuaxun△,PEISujian,XIAJing,WUDongni,LINWen

(ResearchInstituteofParasiticDiseases,HubeiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuhan,Hubei430079,China)

Abstract:ObjectiveTo use the nested PCR technology to diagnose and identify a case of imported Plasmodium ovale wallikeri subspecies.MethodsBlood sample was collected from 1 case of initially diagnosed imported tertian malaria and performed the examination of microscopy,rapid diagnostic tests (RDTs) and nested-PCR.Moreover the sequencing was conduced.ResultsRDTs showed the negative result;the ring form and trophozoite of Plasmodium could be observed in the blood smear by microscopy;the Plasmodium ovale wallikeri subspecies specific primer rOVA1v/rOVA2v was adopted for conducting nested PCR,the specicific amplification band appeared at 760 bp,after sequencing and Blast aligning,its coincidence with the partial sequence of Plasmodium ovale wallikeri subspecies in the Genbank database was 99%.ConclusionThis patient is the first case of Plasmodium ovale wallikeri subspecies infection in Hubei province by nested PCR and sequencing analysis.

Key words:imported malaria;plasomdium ovale wallikeri;nested polymerase chain reaction