吴旭鹏，郭玉刚，牛文斌

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江 佳木斯 154007)



前列腺癌患者血清PCDH10甲基化检测及临床意义①

吴旭鹏，郭玉刚，牛文斌

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江 佳木斯 154007)

摘要：目的：通过测定前列腺癌患者及前列腺增生患者血清中PCDH10基因启动子甲基化水平，探讨其作为一种肿瘤标志物对前列腺癌诊断的临床价值。方法：收集20例前列腺癌患者和20例前列腺增生患者的血清样本作为研究对象，应用甲基化特异性聚合酶链式反映(MSP)方法，测定血清样本中PCDH10基因甲基化状态，同时分析20例前列腺癌患者的临床资料。结果：20例前列腺癌患者中8例检出PCDH10基因甲基化，20例前列腺增生患者中无一例检出PCDH10基因甲基化。将检测结果阳性和阴性两类前列腺癌患者的拎出啊资料进行统计学分析。发现2类患者在年龄、前列腺特异性抗原(PSA值)、以及临床Jewett分期的差别无统计学意义(P>0.05)，但是在Gleason评分的差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：PCDH10基因启动子甲基化仅出现在前列腺癌患者血清中，而在前列腺增生(BPH)患者中未出现，并且PCDH10基因出现甲基化的比率与前列腺癌患者的Gleason评分呈正相关性。

关键词：前列腺癌；PCDH10基因；甲基化；聚合酶链式反应

不断优化前列腺癌的早期筛查条件是近几年的临床研究热点。众所周知，很多疾病的发生和发展，除环境因素外，还与患者自身的遗传特性有着密切的关系。因此，在基因层面寻找前列腺癌分子标记物是人们自然而然想到的方法。目前已经发现一定数量的基因位点被证明与前列腺癌的发生发展相关[1]。在肿瘤的基因检测研究之初，各类癌基因以及抑癌基因的检测样本主要来源于肿瘤组织及各类肿瘤细胞系。直至1948年，血清中存在游离DNA被首次发现，大量的肿瘤工作者才将视线转向血清标本。目前已有多个研究证实前列腺癌组织标本和前列腺癌细胞系中存在PCDH10基因及多种抑癌基因启动子甲基化，但是这些变化是否会出现在血清中仍值得进一步探索。本研究将进一步检测前列腺癌患者血清中PCDH10基因甲基化状态极其临床意义。

1.1样本收集与处理

收集2014-01～2015-06在佳木斯大学附属第一医院泌尿外科住院治疗的20例前列腺癌患者和20例前列腺增生患者的血样本。所有患者均接受手术治疗并由术后病理证实诊断。所有研究对象均登记年龄、PSA值、Jewett分期、Gleason分值。所有受试者于术前清晨空腹抽取静脉血2mL，收集于抗凝管中。收集到的血标本于4℃静止2h，3000rpm/min离心10min，留取上清。所有标本置于-80℃保存。

1.2DNA提取及修饰

取2.5mL血清，采用德国QIAGENamp Blood Mini kit试剂盒提取血清DNA，所有步骤均严格按照试剂盒上步骤逐步操作，最后以50μL DTT洗脱DNA，收集到的DNA使用紫外分光光度计测定波长在260nm处的OD值，计算DNA量，使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳观察DNA条带以及亮度。收集到的DNA样本置于-20℃保存备用。亚硫酸盐修饰采用Methylation-Gold Kit(ZYMO RESEARCH美国)，每0.5μg的DNA经甲基化修饰后使用15μLDTT溶解，置于-20℃保存。

1.3甲基化特异性PCR

以亚硫酸盐修饰后的DNA作为模板，所有引物设计及合成均有上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及PCR反应条件见表1。反应体系为25μL：5X PCRbuffer5μL，10pmol/μL上下游引物各1μL，10mmol/LdNTPs0.5μL,3U/μL Tap酶0.5μL，DNA模板1μL，补ddH2O 16μL。甲基化PCR反应条件见表1。PCR结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，紫外线下观察结果并截取图片。

表1　MSP中PCDH10基因甲基化引物及退火条件

1.4统计学方法

所需数据应用SPSS17.0软件进行处理，以均数±标准差表示，用卡方检验进行分析。P<0.05差异具有统计学意义。

2结果

2.1PCDH10基因在两类不同患者血清学样本中的MSP结果

20例前列腺癌患者中有8例患者血清中出现PCDH10基因甲基化(40%)，见图1。20例前列腺增生患者血清中均未出现PCDH10基因甲基化。二者相比，PCDH10基因甲基化率差异具有统计学意义(P<0.05)。

图1　20例前列腺癌患者的血清PCDH10基因甲基化情况

2.2 血PCDH10基因甲基化与前列腺癌临床资料之间的关系

进一步分析8例前列腺癌患者的临床资料，并与剩下的12例阴性患者的临床资料进行比对，发现两组患者的Gleason评分具有统计学意义(P<0.05)，而与患者的年龄、PSA值和Jewett分期之间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2　PCDH10基因甲基化与前列腺癌临床

3讨论

前列腺癌是泌尿系统的常见肿瘤，很多患者在初诊时即发生远处转移，因此寻找与前列腺癌发生、发展及转移浸润相关的指标一直是广大临床工作者的任务。目前为止，围绕前列腺癌研究相关的血清学标志物主要包括基因及蛋白两个水平。近年来有人再次对前列腺癌患者的血清学样本进行ELISA检测，通过对血清中的EPCA-2指标检测及患者的临床资料对比显示，对于前列腺癌的诊断能力为EPCA-2>FPSA/TPSA>TPSA[2,3]。统计分析后发现即使诊断能力值最高的EPCA-2因子，其特异性依然无法达到100%。而基因诊断中极高的特异性体现出很高的优势，位于肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛的高度甲基化，是一个重要的基因失活机制。这一改变会破坏细胞信号通路的关键环节，而导致恶性转化和肿瘤演进，该机制几乎存在于所有肿瘤中[4]。DNA甲基化是一种重要的是RNA聚合酶Ⅱ转录的基因表达沉默的表观遗传学方式，DNA甲基化可是miRNA表达失调[5]。抑癌基因的异常甲基化导致抑癌基因沉默或失活，是造成肿瘤抑制能力丧失的重要原因，与前列腺癌的发生发展有着密切的联系。

PCDH10(OL-PCDH或KIAA1400)是原钙粘蛋白家族的新成员，该基因位于4q22.2，有5个外显子组成，长约42.26kb[6]。通过生物信息学分析、定向克隆、定点突变和双荧光素酶报告基因检测系统等技术和方法，将人PCDH10基因的核心启动子系列定位于转录起始点上游的一段富含CpG岛的区域内[7]。近年来有人进一步检测了PCDH10mRNA在人体组织中的表达特征，采用荧光定量PCR检测PCDH10mRNA在人体组织中的表达情况，结果显示在前列腺组织中表达量最高，睾丸及肾次之[8]。 此进一步研究前列腺癌患者血清中PCDH10基因启动子甲基化状态具有十分重要的意义。

本研究显示，20例前列腺癌患者中有8例检出PCDH10基因启动子甲基化，而20例前列腺增生患者无一例检出，特异性为100%，敏感性为40%。同时我们发现只有40%的前列腺癌患者血清中发现PCDH10基因启动子甲基化，较相关针对前列腺癌组织样本进行的MSP研究分析所得的60%的阳性率[9]有一定差距，这种现象可能与组织释放至血循环的DNA量较少有关。进行PCR扩增时，作为模板的DNA如果含量不足或浓度太低引起MSP检测灵敏度受限。

进一步分析前列腺癌患者的临床资料，发现阳性组与阴性组患者的Gleason评分差异具有统计学意义，这种现象可能是Gleason评分较高的前列腺癌患者自身的肿瘤细胞凋亡速度比较快，以及肿瘤组织随血液进入血循环的总量增加有关，故释放至循环血液中的DNA量较多。随着释放入血液中的DNA量增加，基因的甲基化进一步影响着PCDH10基因的表达，所以血清中PCDH10基因启动子甲基化研究相对于组织样本和前列腺癌细胞系的研究对于前列腺癌的临床诊断意义更大。

不过我们依然可以看到抑癌基因启动子甲基化检测针对前列腺癌诊断的特异性虽然较高，但比较相比传统的蛋白水平检测，其敏感性较低，这可能是由于技术上的不足，造成的血清样本基因提取和修饰过程中造成的大量DNA丢失有关。不过相信在基因工程飞速发展的今天，该项技术水平的不足将会很快被弥补。

参考文献：

[1]夏国伟.前列腺癌分子诊断标记物的研究与应用[J].中华临床医师杂志，2012，13(6)：14-15

[2]韩旭，罗振国，吴旭鹏,等.探讨血清EPCA-2与FPSA/TPSA值在前列腺癌诊断的关系[J].黑龙江医药科学，2014，37(4)：7-8

[3]王平，罗振国，陈亮.血清EPCA-2与PSA在前列腺癌术前与术后变化情况[J].黑龙江医药科学，2013，36(4)：12-13

[4]Luco RF, Allo M, Schor IE,et al. Epigenetics in alternative pre-mRNAsplicing[J]. Cell,2011, 144(1):16-26

[5]He Y,Cui Y,Wang W,et al.Hypomethylation of the hs-miR-191 locus causes high expression of has-mir-191, and promotes the epithelial-to-mesenchymd transition in hepatocellular carcinoma[J].Neoplasia, 2011,13:841-853

[6]岳根全，徐奔，张莲,等.肾癌组织中PCDH10基因甲基化状态的检测及其临床意义的研究[J].中华临床医师杂志，2013,7(18):8189-8193

[7]Li Z, Xie J, Li W, et al.Identification and characterization of human PCDH10 gene promoter[J].Gene,2011,475(1):49-56

[8]Bertrand KC, Mack SC, Northcott PA, et al. PCDH10 is a candidate tumor suppressor gene in medulloblastoma[J].Childs Nerv Syst,2011,27:1243-1249

[9]刘绍祖，佟明，张骞,等.PCDH10基因在前列腺癌组织中的甲基化测定及临床意义[J].解放军医学院学报，2014,53(4)：379-382

基金项目：①黑龙江省自然基金项目，编号：D201225。

作者简介：吴旭鹏(1989～)男，山西晋城人，在读硕士研究生。 通讯作者：牛文斌(1972～)男，黑龙江佳木斯人，博士，副主任医师，硕士研究生导师。E-mail:niuwenbin@sina.com。

中图分类号：R814.42；R737.25

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)04-0120-02

(收稿日期：2016-03-08)