侯艳妮，李义强，周　昱，王　博，胡少军

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)



LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌浸润过程中的表达及与血管生成的关系①

侯艳妮，李义强，周昱，王博，胡少军

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通过对LGR5、Nodal蛋白在乳腺正常组织、乳腺原位癌、浸润癌中表达水平的研究，探讨LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌发生发展过程中的作用，并且通过研究LGR5、Nodal蛋白与血管生成相关因子CD34在乳腺浸润癌中的关系，进一步探讨两因子在乳腺癌血管生成事件中的作用。方法：应用免疫组化法检测LGR5、Nodal蛋白在30例正常乳腺组织、24例乳腺原位癌、66例浸润癌中的表达水平，并且检测在66例乳腺浸润癌中LGR5、Nodal蛋白与CD34的表达水平，分析LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌发展过程中的作用以及与乳腺癌血管生成之间的关系。结果：LGR5、Nodal在乳腺癌中呈高表达，明显高于原位癌、正常乳腺组织组(P<0.01)。LGR5、Nodal的表达水平均与患者年龄无显著相关性(P>0.05)；与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期显著相关(P<0.01)；LGR5、Nodal分别与CD34、MVD之间存在相关性(P<0.01)，且阳性发生率一致，说明LGR5、Nodal蛋白均与乳腺癌血管生成呈正相关。结论：LGR5、Nodal在乳腺癌发生发展中起重要作用，且可能促进了乳腺癌血管的生成。另外，在乳腺癌中LGR5、Nodal之间存在正相关系。

关键词：乳腺癌；LGR5；Nodal；CD34；血管生成

众所周知，乳腺癌是影响女性身心健康甚则 危及生命的最常见的癌症。因此，研究乳腺癌的各种致病因素、发病机制以及可能的治疗靶点已经成为当代学者迫不及待需要解决的问题。LGR5是最新发现的一种7 次跨膜 G蛋白偶联受体，在人体的多种组织中如脊髓、大脑、眼睛、胃肠道及生殖器官等多处都有表达，是多种组织成体干细胞的标志物。研究证明，LGR5可作为肠等部位的干细胞标志物，且其表达的产物在胚胎和器官的发育以及多种肿瘤的发生、发展中均发挥着重要作用。并且，LGR5在卵巢癌、结肠癌、基底细胞癌以及肝癌中表达均升高[1]。Nodal蛋白是胚胎形成素的一种，是转化生长因子β超家族成员，既可以调控胚胎干细胞的生长和分化，还可以调节肿瘤细胞的可塑性及恶性肿瘤细胞的侵袭，维持胚胎干细胞及恶性肿瘤细胞的分化多潜能性[2]。越来越多的研究发现许多恶性肿瘤如神经胶质瘤、恶性黑素瘤、前列腺癌、子宫内膜癌都可检测到Nodal蛋白的表达，并发现这些肿瘤的发生，发展转移及预后中离不开Nodal蛋白的影响[3]，表明Nodal蛋白可能是肿瘤进展中，肿瘤从可控阶段发展到更具侵袭性及转移性阶段一个重要的标志物。但是，国内外尚没有关于LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌中的研究报道，因此，我们通过研究LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌发展过程中的表达情况，并且通过分析LGR5、Nodal蛋白与血管生成指标CD34之间的相关性，初步探讨LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌发生发展中的可能性作用，为临床研究提供更多的试验证据。现报道如下。

1资料和方法

1.1一般资料

收集2014-05～2015-05佳木斯大学附属第一医院肿瘤科乳腺疾病手术切除标本，其中乳腺正常组织30例、原位癌24例、浸润癌66例。入选标准：1)所有患者均为女性；2)所有患者术前均未经过放化疗、生物治疗及中西医结合治疗；3)所有标本均经佳木斯大学附属第一医院病理科资深病理医生进行读片确定诊断。

1.2 试验

1.2.1试验方法

采用免疫组化法：三组组织标本均经福尔马林固定，石蜡包埋存档，标本做3μm厚度连续切片及HE染色。采用SP法检测LGR5、Nodal、CD34在不同标本中的表达。实验方法严格按照实际说明书进行操作。

1.2.2结果判定

阳性结果判断：细胞质、细胞核呈黄色者判为阳性。先在低倍镜下对组织切片全面观察，随后在200倍的光镜下随机观察5个视野。通过将细胞的阳性的强度评分和阳性细胞的百分比评分相加来综合判断染色结果。

微血管密度(MVD)计数：先在40倍显微镜下观察病理，选择出癌灶内微血管密度最密集的三个区域，然后再在200倍镜下计数每个区域中的MVD，取三个区域的平均值作为该张肿瘤切片的微血管密度。

1.3统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，等级资料进行秩和检验，一般性分类资料采用Pearson卡方检验进行分析，以P<0.05表示有统计学意义。两变量间相关性采用 Spearman 相关分析，检验水准α=0.05。

2结果

2.1LGR5、Nodal蛋白、CD34在乳腺正常组织、乳腺原位癌、浸润癌中的表达

LGR5阳性染色表现为均匀细小黄色颗粒，主要分布于细胞质，其在乳腺正常组织、原位癌、浸润癌中阳性率分别为：13.33%(4/30)、54.17% (13/24)、89.39% (59/66)。Nodal蛋白的阳性反应同样主要表现在乳腺病变组织的细胞质中，其在乳腺正常组织、乳腺原位癌、浸润癌中的阳性表达率为6.67%(2/30)、58.33%(14/24)、80.30%(53/66)。两组因子在乳腺癌中表达明显高于乳腺正常组织组及原位癌组，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表1。

2.2LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌中的表达及与临床病理的关系

我们进一步分析了LGR5、Nodal与血管生成相关蛋白CD34表达与乳腺癌患者临床病理特征的关系，LGR5、Nodal、CD34表达水平与肿瘤大小、组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移均有显著相关(P<0.05)；与年龄无显著相关(P值分别为：0.267、0.629、0.916)。见表2。

表1　LGR5、Nodal蛋白、CD34在乳腺正常组织、乳腺原位癌、浸润癌中的表达

表2　LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌中的表达及与临床病理的关系

注明：1.#表示采用秩和卡方检验进行计算；2.*表示采用Fisher 精确概率卡方检验进行计算。

2.3LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌组织中表达与MVD之间的关系

乳腺癌组织标本LGR5、Nodal蛋白和 CD34免疫组化染色情况提示：LGR5、Nodal蛋白阳性表达均多位于肿瘤细胞质；微血管密度采取癌组织CD34免疫组化染色方式检测，染色也主要位于细胞质。 同时，对乳腺癌组织中LGR5、Nodal蛋白、MVD表达相关性进行了分析，结果提示，LGR5阳性表达与CD34阳性表达间存在显著相关(P<0.01)；Nodal蛋白阳性表达与CD34阳性表达之间也存在显著相关(P<0.01)，且LGR5与Nodal之间亦有显著相关(P<0.01)。见表3～5。

表3　Lgr5、CD34and MVD 在乳腺癌组织中

表4　Nodal、CD34 and MVD 在乳腺癌组织中

表5　Lgr5、Nodal在乳腺癌组织中表达相关性分析

3讨论

乳腺癌是一种内分泌依赖性肿瘤,除ER、PR外,包括LGR5、Nodal在内的多种因子均可能参与乳腺癌的发生发展。因此,阐明LGR5、Nodal等在乳腺癌发生中的作用及相关机制对于乳腺癌的内分泌治疗研究非常必要。近年来,大量实验研究表明LGR5、Nodal均可以参与肿瘤的发生发展，促进肿瘤血管生成，但其各自在乳腺癌中的表达尚没有见文献报道。

我们首先分别检测了LGR5、Nodal在乳腺正常组织、乳腺原位癌、乳腺癌及浸润癌组织中的表达。相比于在正常组织及乳腺原位癌，LGR5、Nodal在浸润癌组织中呈现明显的高表达。这同我们预计结果相同。我们进一步分析发现在乳腺癌组织中,LGR5、Nodal的高表达与乳腺癌的肿瘤大小、分级、TNM分期、淋巴结转移成正相关。肿瘤的生长需要新的微血管生成,而新的血管生成提供了肿瘤的血液营养供应,也增加了恶性肿瘤转移机率,故微血管密度在许多原发肿瘤中已被作为判断生物学侵袭性和转移潜能的指标。而生成血管的血管内皮细胞染色可以清楚地显示肿瘤的血管密度, 反映肿瘤的生物学特性。CD34作为一种血管内皮染色剂，灵敏度高，干扰小，清晰度好[4]，所以我们又在浸润癌中检测了血管生成相关因子CD34的表达情况，并且在高倍显微镜下计数微血管密度，分别统计分析LGR5、Nodal与CD34、MVD之间的相关性，结果示：LGR5、Nodal与CD34、MVD之间均呈正相关，并且LGR5、Nodal之间也为正相关，这就说明了LGR5、Nodal可能促进了乳腺癌的血管生成。总结来说,LGR5、Nodal在乳腺癌发生发展中起重要作用，可能通过促进乳腺癌细胞增殖、血管生成、转移等多种机制促进乳腺癌的发生进展。但由于实验样本过少，而且国内外尚没有此方面的文献报道，所以LGR5、Nodal在乳腺癌中的具体作用有待进一步的研究证明。

目前，学者们还未发现乳腺干细胞确切的标志物[5]，部分学者发现，乳腺干细胞定位于末端导管小叶单位；而另有研究人员研究则显示乳腺干细胞位于基底上皮层。LGR5、Nodal能否作为乳腺干细胞标志物还需进一步研究来证实。也有人称LGR5是横跨胚层的干细胞标志物，或许能代表成体干细胞的普遍标志物，但这个结论尚有待更多研究证实。而β超家族成员Nodal蛋白仅表达于人类胚胎干细胞、胚胎组织以及肿瘤细胞中，目前已发现多种肿瘤细胞的细胞株中存在Nodal的表达，如睾丸癌的移植瘤、转移性黑色素瘤、胃腺癌、神经胶质瘤、前列腺癌、膀胱肿瘤等。研究发现Nodal蛋白可促进内皮细胞形成管状血管网状结构即血管生成拟态的形成，并且可以诱导VEGF的分泌，从而促进肿瘤血管生成，进而促进肿瘤的发生发展。在今后的研究中，我们希望进一步探讨LGR5、Nodal通过何种机制促进恶性乳腺癌发生发展以及血管生成，明确两因子在促进乳腺癌生成中是否为必要条件，从而为乳腺癌的临床工作提供更有力的证据。

参考文献：

[1]吴晓松.Lgr5在干细胞及肿瘤中的研究进展[A].医学综述，2014，20(6):1026-1028

[2]Jams D，Levine AJ，Besser D，et al.TGF beta/action/nodal signaling is necessary for the maintenancer of pluripotency in human embryonic stem cell [J]. Development, 2005,132(6):1273-1282

[3]Bar-Eli M.Back to the embryonic stage:Nodal as a biomarker for breast cancer progression [J].Bar-Eli.Breast Cancer Research,2012,14:105

[4]王国文，王祖义.CD31与 CD34显示非小细胞肺癌微血管密度的对比分析[A].基础医学，2009，34(3):185-187

[5]王新，范立君.GRP78、GRP94在乳腺癌中的表达及其意义[A].黑龙江医药科学，2014，37(6):89-91

基金项目：①佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LM2015_032

作者简介：侯艳妮(1987～)女，陕西宝鸡人，在读硕士研究生。 通讯作者：李义强(1961～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail：471742477@qq.com。

中图分类号：R737.9

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)04-0031-03

(收稿日期：2015-09-24)