刘艳丽，艾迎春

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)



醛固酮受体拮抗剂联合甘草酸二铵对大鼠肝纤维化进程的影响①

刘艳丽，艾迎春

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要：目的：利用醛固酮受体拮抗剂联合甘草酸二铵干预肝纤维化大鼠并检测血清中透明质酸(hyaluronic acid, HA)和血管紧张素1-7(angiotensin (1-7) ,Ang(1-7))的变化，探讨联合用药对大鼠肝纤维化进程的影响。方法：40只健康雄性SD大鼠用完全随机的方法，随机分成5组：正常对照组、模型组、螺内酯+甘草酸二铵联合治疗组、甘草酸二铵治疗组、螺内酯治疗组。于20、40、60d分别取血，并于60d处死全部SD大鼠，取肝组织做切片处理，HE染色，镜下观察比较各组大鼠肝脏组织结构变化。采用ELISA法测定各组大鼠大鼠血清HA和Ang(1-7)水平的变化。采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差±s)表示。组间比较釆用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析，多重比较采用LSD-t检验(方差齐)，或釆用Dunnett -t检验(方差不齐)，P<0.05为有统计学意义。结果：与正常对照组比较，20、40、60d各组HA及Ang(1-7)水平均升高(P<0.05)，且呈逐渐升高趋势，而与模型组比较，药物治疗组HA水平降低(P<0.05)，但Ang(1-7)水平升高(P<0.05),联合治疗组HA水平更低、Ang(1-7)水平更高。甘草酸二铵治疗组和螺内酯治疗组组间比较无明显差异(P>0.05)。结论：醛固酮受体拮抗剂联合甘草酸二铵对大鼠肝纤维化进程有治疗作用，随肝纤维化进展，血清Ang(1-7)水平升高，且药物治疗后其水平升高更明显，提示Ang(1-7)参与肝纤维化发生发展过程。

关键词：肝纤维化；醛固酮受体拮抗剂；血管紧张素1-7

肝纤维化不是一个独立的疾病，它是各种致病因子长期损伤肝组织而致慢性肝病的共同病理过程，同时也是肝脏对各种损伤的一种愈合反应，是慢性肝病发展成肝硬化的必经阶段。肝纤维化以窦周间隙大量细胞外基质沉积所致的肝内结缔组织增生为特点。透明质酸由肝星状细胞合成的一种糖胺多糖，研究显示HA是目前诊断肝硬化最敏感标志物。以往人们认为肾素-血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)具有促纤维化作用。近些年，ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴引起人们的关注，研究发现其为ACE-AngⅡ-AT1的反向调节轴，具有改善纤维化作用，两轴相互制约。Ang(1-7)是ACE2-Ang(1-7)-Mas的主要活性物质，对纤维化具有保护作用[1,2]。中药治疗肝纤维化已成为目前研究的主要方向[3]。甘草是一味中药，甘草酸是其最重要成分之一，具有保肝和稳定细胞膜、抗氧化、抗炎、抗过敏、抗溃疡、免疫调节、抗病毒、抗癌等作用[4]。

临床上螺内酯作为保钾利尿剂对肝硬化肝硬化失代偿出现腹水并发症疗效确切，螺内酯同时又是RAS中的醛固酮受体拮抗剂，是否可以应用于肝纤维化早期，临床上对此研究较少，本实验通过40%CCl4诱导大鼠肝纤维化模型，于20、40、60d分别取血，螺内酯联合甘草酸二铵干预观察大鼠肝纤维化指标HA及Ang(1-7)水平变化，并于实验结束取肝组织行HE染色，观察各组大鼠肝脏结构变化，进一步阐述RAS和肝纤维化的关系，观察Ang(1-7)在大鼠肝纤维化进程中的变化，进而观察醛固酮受体拮抗剂联合甘草酸二铵对大鼠肝纤维化进程是否有延缓作用，并探讨其是否可以作为肝纤维化的一项检测指标。

1材料与方法

1.1实验材料

雄性SD大鼠(200±10)g，购自佳木斯大学实验动物中心；饲料由佳木斯大学实验动物中心提供；四氯化碳购自天津大茂化学试剂厂；甘草酸二铵购自正大天晴药业集团股份有限公司；螺内酯片购自北京中新制药厂；HA和Ang(1-7)ELISA试剂盒购自上海巍樊生物有限公司。

1.2实验动物分组

40只4～6周龄SD雄性大鼠, 体重(200±10)g，称重后按体重大小依次编为1，2，3，…，40号，用完全随机的方法，随机分成五组：正常对照组、模型组、甘草酸二铵治疗组、螺内酯治疗组、螺内酯+甘草酸二铵联合治疗组，每组8只。

1.3实验方法1.3.1肝纤维化大鼠模型制备

SD大鼠适应性饲养一周。正常对照组皮下注射玉米油，3mL/kg，首次5mL/kg；其余各组动物均进行肝纤维化模型制备: 以40%四氯化碳CCl4(CCl4:玉米油=1:4)，皮下注射 3mL/kg，首次5mL/kg，2次/周，共60d。

1.3.2给药治疗

在制备模型的同时，甘草酸二铵治疗组、螺内酯治疗组和联合治疗组均灌胃给药，甘草酸二铵60mg/kg，螺内酯每日按100mg/kg，制成1mL溶液灌胃，1次/天，共60d，正常对照组和模型组均予等体积生理盐水灌胃。

1.4标本采集及指标检测

分别于20、40、60d眼眶取血，双抗体夹心酶联免疫吸附实验(ELISA法)测血清纤维化指标HA及Ang-(1-7)，按试剂盒说明书操作。于实验结束处死全部SD大鼠，10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射进行麻醉，消毒后固定，沿腹部正中剪开皮肤，取肝组织清洗，将部分肝右叶于10%的中性福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，切片，常规脱蜡，进行HE染色。光镜下观察比较各组大鼠肝脏组织结构变化。动物尸体按实验动物中心要求处理。

1.5统计学方法

2结果

除模型组大鼠于第7、8周各死亡1只，其余大鼠无皮下脓肿，无舔咬自噬均进入实验结果分析。一般情况：正常组大鼠一般情况良好，食欲好，毛色光亮，体重增加较快，体重持续增加，无死亡。模型组大鼠厌食，毛色晦暗，消瘦，尿色加深，死亡2只，体重增加缓慢，6周后体重无明显增加。与模型组比较，药物治疗组大鼠食欲尚可，毛色较好，体重增加较慢，无死亡。

2.1HA的变化

与正常对照组比较，模型组HA水平升高(P<0.05)，并呈逐渐上升趋势。与模型组比较，药物治疗组HA水平降低，联合治疗组降低程度最大(P<0.05)。甘草酸二铵较螺内酯组HA降低，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血清HA检测结果

注：※P<0.05，与正常对照组相比较;☆P<0.05，与模型组相比较;#P<0.05，与联合治疗组相比较，模型组60d(n=6)。

2.2Ang(1-7)的变化

较正常对照组，各组Ang-(1-7)水平均升高(P<0.05)，并呈逐渐上升趋势。药物治疗组Ang-(1-7)水平较模型组升高，差异有统计学意义。联合治疗组较螺内酯组或甘草酸二铵组Ang-(1-7)水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。甘草酸二铵组较螺内酯组Ang-(1-7)水平升高，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3大体标本

模型组与正常对照组比较，肝组织表面光亮度减低，边缘不规整，颜色暗红，质脆，表面可见小颗粒状结节，呈橘皮样。药物治疗组的肝组织色泽、质地、表面光滑度较肝纤维化组均有明显改善，以联合治疗组为著。

2.4组织形态学改变

HE染色正常对照组大鼠肝细胞形态规整，以中央静脉为中心呈放射状规则排列，肝小叶结构正常，无变性坏死，肝索排列整齐，几乎见不到成纤维细胞，未见炎细胞浸润；模型组大鼠肝细胞排列紊乱，一些细胞呈空泡状脂肪变性，胞质疏松，伴汇管区炎细胞浸润，肝细胞再生明显，肝索及肝小叶结构紊乱失去正常结构，汇管区扩大见胶原沉积，肝小叶内见纤维间隔形成，部分切片见假小叶及结节形成。与模型组比较，给药组，肝组织纤维化程度减轻，汇管区扩大，大部分小叶结构清晰，少量纤维间隔形成，未见假小叶，其中以联合治疗组纤维化程度减轻最明显,见图1。

表2　各组大鼠血清Ang(1-7)检测结果

注：※P<0.05，与正常对照组相比较；☆P<0.05;与模型组相比较;#P<0.05，与联合治疗组相比较，模型组60d(n=6)。

图1　各组大鼠肝脏HE染色结果

3讨论

目前肝纤维化治疗仍是医学一大难题，临床上尚无有效药物可有效控制或逆转肝纤维化。甘草酸在临床上对肝损伤及纤维化有治疗作用，螺内酯作为RAS成分用于肝纤维化治疗，二者联合治疗在临床上研究较少。甘草酸二铵具有糖皮质激素样作用[5]，具有抗炎抗氧化作用，可以减轻炎细胞浸润，改善炎症反应减少胶原成分及细胞外基质沉积，延缓纤维化进展。甘草酸二铵与醛固酮的类固醇环结构类似，螺内酯结构也与醛固酮相似，竞争性结合受体，可发挥类固醇样作用，但不会有激素的相关不良反应[6]。不同的动物体内外实验证实甘草酸对CCl4诱导的急慢性肝损伤及肝纤维化有明显的改善作用，甘草酸还可促进肝组织再生和修复能力。李旭等研究发现肝纤维化时肝脏肝星状细胞编码醛固酮合成关键酶的基因CYPⅡB2表达上调[7]，该试验显示二者联合治疗较单药治疗肝纤维化程度减轻明显。

以往认为RAS具有促纤维化作用。局部RAS主要与组织重构和纤维化有关。肝纤维化过程中，CY P IIB基因明显上调。局部ALD合成也受RAS调节。曾认为醛固酮主要作用于肾脏远曲小管，起到保钠排钾作用，自20世纪末研究发现一些肾上腺外组织同样能合成分泌ALD，是一种促纤维化因子。螺内酯为醛固酮受体拮抗剂，既能抑制肝纤维化形成又能抑制肝窦血管生成，通过与醛固酮竞争性结合受体，可以拮抗醛固酮的促纤维化过程。郑善英等发现在慢性肝炎和肝硬化患者，血浆中AT-Ⅱ和醛固酮均有升高[8]。近些年，ACE2-Ang(1-7)-Mas受体轴引起人们的关注，研究发现其为ACE-AngⅡ-AT1的反向调节轴，具有改善纤维化作用。Ang(1-7)与Mas受体结合，抑制HSCs活化，拮抗ACE-AngⅡ-AT1的促纤维化作用，可产生扩张血管、降低血压、抗细胞增殖、抗纤维化、调节水钠代谢等作用，该轴在人类慢性肝损伤和BLD大鼠肝脏明显上调[9]。研究发现丙肝患者，随着纤维化进展血浆Ang-(1-7)浓度增加，且呈正相关[10～12]。

在缺乏活组织病理检查的条件下，肝血清学指标可以作为评价肝纤维化的方法。透明质酸由肝星状细胞产生的一种糖胺多糖，经淋巴道入血，后随血液循环到达肝脏，与肝窦内皮细胞受体结合，被胞浆内透明质酸酶分解。肝纤维化时，肝窦毛细血管化，内皮细胞功能受损，间质合成HA增多，而HA分解减少，使血清中HA水平升高[13]。研究显示HA是目前诊断肝硬化最敏感标志物，是目前临床上常规肝纤维化检测指标，可以反映肝纤维化程度。在早期HA升高时Ang-(1-7)即升高，药物治疗组升高显著，提示其与肝脏受到损伤后自身启动修复程序有关，对肝纤维化有保护作用，通过对其动态观察，可作为肝纤维化的一项早期检测指标，结合其他无创检测指标诊断早期肝纤维化。为肝纤维化无创检查提供了理论支持，具有积极的临床意义。

该实验观察60d，病理切片提示肝脏假小叶形成，没有出现腹水等并发症，并未到肝硬化晚期阶段，因此对于晚期肝硬化该指标的变化还缺乏进一步研究。该实验是检测循环血血清学指标，缺乏对局部组织该指标的对照，检测局部组织需处死动物，无法实施对个体的连续性观察，另外，从临床可行性方面来讲，检测局部组织成分也存在困难，只能通过外周血指标变化，反应局部组织学变化。

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基金项目:①佳木斯大学研究生科技创新项目，编号：LM2015_043。

作者简介:刘艳丽(1988～) 女，河北承德人，在读硕士研究生。 通讯作者:艾迎春(1960～) 女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，硕士研究生导师。E-mail: haiyan7416_ncmc@163.com。

中图分类号：R575.2

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)04-0022-04

(收稿日期：2015-10-13)

The influence and clinic significance of aldosterone acceptor antagon associate with diammonium glycyrrhizinate on the proceeding of rat hepatic fibrosis

LIUYan-li,AIYing-chun

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Abstract:Objective: To intervene rat hepatic fibrosis with aldosterone acceptor antagon association with diammonium glycyrrhizinate; and to detect the changes of hyaluronic acid (HA) and angiotensin (1-7) (Ang(1-7)) level in serum, so as to probe the influence and likely mechanism of treating with association medicine on rat hepatic fibrosis. Methods: 40 male healthy Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into five groups: control group, hepatic fibrosis model group, association treatment group, diammonium glycyrrhizinate treat group, spironolactone treat group. Their blood were taken separately in the 20th, 40th and 60th days. After the 60th day, all SD rats were sacrificed. The liver tissue of all rats were taken, and then made paraffin section and HE staining. The changing differences of the rats’ liver tissue in each group were observed by microscope and compared. The serum HA and Ang(1-7) levels were tested by ELISA. All statistical analysis were performed with SPSS17.0, and shown by mean±standard ±s). The intergroup comparison were taken by One-way ANOVA. Multiple comparison were taken by LSD-t test or Dunnett -t test. It is considered statistical significance when P is less than 0.05. Results: Compared with the normal control group, the HA and Ang(1-7) levels in each group are step up in the 20th, 40th and the 60th days, and has the gradually step up tendency. While compared with the model group, the HA level in the drug treatment groups were decreased(P<0.05), but the Ang(1-7) levels were increased(P<0.05). In association treatment group, there are less levels of HA, and higher Ang(1-7) levels. The comparasion between diammonium glycyrrhizinate treat group and spironolactone treat group has no significant difference. Conclusion: Aldosterone acceptor antagon associate with diammonium glycyrrhizinate can daly the proceeding of rat hepatic fibrosis. As the development of hepatic fibrosis, the serum Ang(1-7) levels increase, and after the drug treatment the increasing is more significant, which suggests that Ang(1-7) is involed in the development of rat hepatic fibrosis, and it may be a protective indel during liver fibrosis.

Key words:hepatic fibrosis; aldosterone acceptor antagon; Ang(1-7)