杜从林，罗振国，桂士良，迟宝进，郝　鹏

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江 佳木斯 154003)



Hhcy大鼠血浆Hcy与阴茎海绵体H2S的相关性①

杜从林，罗振国，桂士良，迟宝进，郝鹏

(佳木斯大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江 佳木斯 154003)

摘要:目的：研究高同型半胱氨酸血症(Hhcy)大鼠血浆同型半胱氨酸(Hcy)浓度和阴茎海绵体组织硫化氢(H2S)含量之间的关系。 方法：将24只健康雄性Wistar大鼠适应喂养1周后随机分为8只正常组(C组)和16只模型组，给予C组(生理盐水3mL/次)和模型组(生理盐水3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1)早晚各1次灌胃，持续6周。6周后采血测模型组血浆Hcy浓度均大于16.0μmol/L，提示造模成功，随机将模型组分为Hhcy组(H组)和叶酸、vitB12组(V组)各8只，给予H组(生理盐水3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1)和V组(生理盐水 3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1+叶酸0.5mg·kg-1·d-1+vitB1250μg·kg-1·d-1)继续灌胃6周后测血浆Hcy和H2S浓度，0、5V下阴茎海绵体内压/平均颈动脉压(ICPmax/MAP)检测后取阴茎组织测H2S含量。 结果：随着C组、V组、H组之间血浆Hcy浓度依次增高，而大鼠ICPmax/MAP(0、5V)值逐渐降低，阴茎组织H2S含量依次均显著性降低(P<0.05)，且血浆Hcy浓度与阴茎组织H2S含量之间为负性相关。 结论：随着血浆Hcy浓度增高，致使阴茎海绵体内源性H2S含量降低，这可能是Hhcy致勃起功能下降的原因之一，且叶酸和维生素B12能够有效的降低血浆Hcy浓度，改善勃起功能。

关键词:硫化氢；同型半胱氨酸；勃起功能障碍；阴茎海绵体

近年来勃起功能障碍(ED)发病率持续升高，其病因复杂多样，如：Hhcy、心血管病、糖尿病等。Hhcy指血浆Hcy水平升高超过16.0 μmol/L者[1]。桂士良等研究发现，Hhcy性ED机制可能是血浆Hcy升高致阴茎海绵体内NO与CO含量下降[2]。郝鹏等人证实，Hhcy大鼠的血浆Hcy与其勃起功能之间有负相关性，且叶酸和vitB12能够有效降低血浆Hcy浓度并改善其勃起功能[3]。H2S是近些年发现的具有舒血管效应和促进阴茎勃起的新型气体分子递质。我们前期实验已证实阴茎组织内源性H2S含量降低是老年性ED的发病原因之一，且阴茎组织H2S含量与勃起功能之间具有正相关性[4，5]。但Hhcy性ED中血浆Hcy水平与H2S含量的关系尚不明确。此次实验旨在研究Hhcy大鼠血浆Hcy浓度和阴茎海绵体H2S含量之间的关系。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物及模型建立：健康雄性2月龄Wistar大鼠(购于哈尔滨医科大学动物实验中心)24只，适应喂养1周后称重，体重相差均在30g以内，且均有正常性功能，随机分为两组(8只正常组，记为C组；16只为模型组)，分别给予C组(生理盐水3mL/次)和模型组(生理盐水 3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1)早晚各1次灌胃，C组持续12周，而模型组持续6周后眶后静脉采血示模型组血浆Hcy均大于16.0μmol/L，将模型组随机分为Hhcy组(H组)和叶酸、vitB12组(V组)各8只，分别给予H组(生理盐水 3mL/次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1)和V组(生理盐水 3mL次+蛋氨酸1g·kg-1·d-1+叶酸0.5mg·kg-1·d-1+vitB1250μg·kg-1·d-1)继续灌胃6周后采血测血浆Hcy浓度。

1.1.2主要试剂材料：叶酸(江苏亚邦爱普森药业有限公司)，vitB12片(山西云鹏制药有限公司)，RM6240型多导生理信号采集处理系统和酶标仪由佳木斯大学实验中心提供。

1.2实验方法

1.2.1测定血浆Hcy：于灌胃12周后每只大鼠采血2mL，以4000 r/min速率离心10min，取上清送至佳木斯大学附属第一医院生化室测定血浆Hcy值。

1.2.2ICP/MAP检测：用1%戊巴比妥钠50mg/kg对C组及造模成功的H组大鼠行腹腔注射，麻醉满意后于颈部正中取一纵行切口，依次切开皮肤和颈部肌肉显露气管，紧贴气管左侧暴露左侧颈总动脉和迷走神经，行颈总动脉插管来监测MAP。于阴茎背侧显露出阴茎海绵体，刺入充满肝素盐水24G针头后接三通管并连压力转换器以测定ICP。盆神经节紧邻前列腺后外侧缘，打开腹腔并找出盆神经节将其作为电刺激部位且给予电刺激(刺激参数：0、5V，25Hz，2ms；刺激持续1min间隔5min后重复)，用RM6240型多导生理信号采集处理系统来记录第1、7分钟ICPmax/MAP 值。

1.2.3血浆H2S浓度测定：取一1.5mL的EP管，依次加入250μL的1%醋酸锌、400μL三蒸水、100μL大鼠新鲜血浆、133μL的20mmol/L对苯二铵盐酸盐以及三氯化铁(30mmol/L，133μL)，室温孵育10 min后加入250μL的10%三氯乙酸，离心(4℃,17500g)10min后取上清液于96孔板中，用酶标仪测670 nm波长的吸光度并算得血浆H2S浓度。

1.2.4测定阴茎海绵体组织H2S的含量和生成率 测压后以1%戊巴比妥钠对各大鼠以安乐死方式处死并截取阴茎海绵体，以PBS液(10 mmol/L，pH7.4)对其脱血处理，将阴茎海绵体组织和PBS液(0.10mol/L，pH 7.4)以10:1比例制成组织匀浆，取0.5mL匀浆于1.5mL的EP管中并依次加入20μL-半胱氨酸(0.01mol/L)、30μL生理盐水及20μL 5-磷酸吡哆醛(2mmol/L)，将EP管置于37℃温水中30min后先后加入1%(W/V) 乙酸锌及10%(W/V)三氯醋酸各250μL，继续37℃温水静置60min，先后加入对苯二铵盐酸盐(20mmol/L)和三氯化铁(30mmol/L)各133μL，20min后加样于孔板中并用酶标仪测670nm 波长处吸光度，以 nmol/mg 表示组织中H2S含量。

1.3统计学方法

2结果

2.1血浆Hcy浓度、勃起功能及阴茎内源性H2S含量比较

两组大鼠体重、血浆Hcy和H2S的浓度、ICPmax/MAP(0、5V)值、阴茎组织H2S含量与生成率见表1。

表1　两组大鼠体重、血浆Hcyt和H2S浓度、ICPmax/MAP(0、5V)、海绵体H2S含量及生成率比较

与C组比较，aP<0.05;与H组比较，bP<0.05。

2.2血浆Hcy与海绵体H2S含量的相关性分析

三组大鼠血浆Hcy水平与阴茎海绵体组织H2S含量之间均呈负相关性，见表2。

表2　大鼠血浆Hcy值与阴茎海绵体H2S含量的相关性

3讨论

一项国内的流行病学报告显示，与2003年相比，中度和重度ED患者分别增加了2倍和10%，中长病程ED患者增加了2～3倍[6]。ED和许多疾病因素如Hhcy、糖尿病、代谢综合征、高血压等有关[7]。Hcy是由饮食吸收的蛋氨酸(Met)硫化而形成，通过甲基团转移活化S-腺苷蛋氨酸转变为Hcy。Hcy代谢循环有两条途径：第一是在vitB12作为Met合成酶作用下，甲基供体(N5-甲基四氢叶酸)重新甲基化生成Met；第二是vitB6为辅酶的胱硫醚-β-合成酶(cystathi-onine-beta-synthase，CBS)催化Met与丝氨酸缩合生成胱硫醚，后者在胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine gamma-lyase, CSE)催化下分解成H2S、半胱氨酸和α-酮丁酸，此为合成谷胱苷肽的重要途径，可使细胞中许多成分免受氧化破坏[8]。血浆Hcy水平与遗传、环境、年龄、吸烟、恶性肿瘤等因素密切相关，任何因素及代谢酶(CBS、CSE等)和辅助因子(叶酸、vitB12等)的缺乏均可致血浆中Hcy异常蓄积而出现Hhcy。高Hcy是多功能的损伤因子，它能诱导血管局部的炎症细胞释放多种炎症因子致使动脉粥样硬化和血栓形成；同时还可以诱导内皮细胞和平滑肌细胞产生内质网应激，使内质网蛋白出现错误的重叠，损伤平滑肌与内皮细胞功能；可以刺激血管平滑肌细胞过度增殖与重塑；也可以通过增加活性氧的含量来直接抑制内皮舒张并损伤内皮细胞和平滑肌细胞的功能；此外，Hhcy大鼠阴茎海绵体中血红素氧合酶-2(HO-2)和一氧化氮合酶(NOS)表达减弱导致其相应的CO和NO含量下降也是Hhcy性ED的发病原因之一[9]。

内源性H2S主要由两种依赖磷酸吡哆醛的关键酶(CSE和CBS)以Hcy代谢过程中的L-半胱氨酸为底物而合成[10]。H2S在体内以1/3的气体H2S和2/3的NaHS形式存在。H2S可以通过刺激内皮细胞产生内皮源性超极化因子(EDHFs)和血管内皮细胞舒张因子(EDRFs)来舒张血管平滑肌，而对海绵体的松弛作用仅部分地依赖于阴茎勃起的环磷酸腺苷(cAMP)或环磷酸鸟苷(cGMP)系统的经典途径，它主要是通过激活ATP敏感的钾离子(K+-ATP)通道使膜电位发生超极化反应，致受膜电位影响的电压依赖性Ca2+通道关闭使平滑肌松弛。此外，H2S还可与NO、CO和睾酮以协同作用作用的方式来促使平滑肌舒张，且H2S通过抑制Bcl-2蛋白表达而抑制平滑肌的增殖和促进细胞的凋亡，以及抑制NADPH氧化酶(一种产生超氧化物的重要酶)的表达和抑制TNF-α等诱导超氧化物的形成来改善平滑肌和内皮细胞功能从而改善勃起功能。

本实验结果显示，H组血浆Hcy水平明显高于C组，经给予补充叶酸和vitB12治疗后其血浆Hcy水平明显下降，故V组血浆Hcy水平显著低于H组。而勃起功能ICPmax/MAP(0、5V)值、血浆H2S浓度、阴茎海绵体H2S含量和生成率均依次为C组>V组>H组，且血浆Hcy水平与阴茎海绵体H2S含量呈负性相关。这说明随着血浆Hcy水平的升高，高浓度Hcy通过氧化应激及刺激血管平滑肌细胞过度增殖与重塑等机制来损伤内皮和平滑肌细胞的功能，直接或间接的致使阴茎组织生成H2S能力减弱，内源性H2S含量减少，最终致大鼠的勃起功能下降。采用及时补充叶酸和vitB12能有效的降低血浆Hcy水平并增加内源性H2S的量，从而改善Hhcy大鼠的勃起功能，但高浓度的Hcy如何导致H2S含量的减少和Hhcy致勃起功能下降的具体作用机制有待进一步深入研究。

参考文献:

[1]高雨田，彭 鹏，褚春沐，等. 42例脑梗死患者血清同型半胱氨酸水平研究[J]. 黑龙江医药科学，2015，38(1):86-87

[2]桂士良，曹会峰，马红斌，等. 2型糖尿病大鼠血浆同型半胱氨酸与阴茎海绵体内NOS和内源性CO的相关性研究[J]. 中华男科学杂志，2012，18(2):126-129

[3]郝鹏，李坚，罗振国，等. 高同型半胱氨酸血症大鼠与勃起功能障碍的相关性研究[J]. 黑龙江医药科学，2013，36(1):97-98

[4]迟宝进，杜从林，李淑奎，等. 不同月龄大鼠阴茎海绵体内硫化氢含量与勃起功能的相关性[J]. 中国老年学杂志，2015，35(13):3524-3526

[5]张天宇，杜从林，迟宝进，等. 增龄对大鼠阴茎海绵体内CSE及H2S含量变化的影响[J]. 黑龙江医药科学，2015，38(4):137-140

[6]刘德风，姜辉，洪锴. 近5年来中国11个城市门诊勃起功能障碍患者的流行病学变化[J]. 中华男科学杂志，2009，15(8):724-726

[7]倪凯，陈斌，杨昊，等. 青年男性勃起功能障碍与代谢综合征相关性研究分析[J]. 临床泌尿外科杂志，2012，27(9):678-681

[8]汪春晖，黄宇烽. 高同型半胱氨酸血症与勃起功能障碍研究进展[J]. 中华男科学杂志，2011，17(11):1019-1022

[9]Qin WB，Huang WJ，Chi BJ，et al. Effects of plasma Hcy on the contents of CO and HO-2 in the corpus cavernosum of ED rats with hyperhomocysteinemia [J]. Zhonghua Nan Ke Xue，2013，19(5):398-402

[10]黄一鸣，程勇，姜睿. 硫化氢与阴茎勃起功能关系研究进展[J]. 中华男科学杂志，2012，18(9):823-826

基金项目：①黑龙江省自然科学基金项目，编号：H2015073。

作者简介：杜从林(1986～)男，湖北麻城人，在读硕士研究生。 通讯作者：桂士良(1972～)男，黑龙江林口人，在读博士研究生，副主任医师，硕士研究生导师。E-mail：guishiliang2008@163.com。

中图分类号:R697+.1

文献标识码:A

文章编号：1008-0104(2016)04-0016-03

(收稿日期：2015-12-07)

The correlation between plasma homocysteine and contents of hydrogen sulfide in the corpus cavernosum of hyperhomocysteinemia in rats

DUCong-lin，LUOZhen-guo，GUIShi-liang，CHIBao-jin，HAOPeng

(Department of Urinary, The First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154003，China)

Abstract:Objective: To study the relationship between plasma homocysteine(Hcy) and contents of hydrogen sulfide(H2S) in the corpus cavernosum of hyperhomocysteinemia(Hhcy) rats; and to explore the mechanism of Hhcy rats with decreased erectile function. Methods：Twenty four healthy male wistar rats were fed in the same conditions. One week later, they were randomly divided into control group (C group with eight rats) and model group (sixteen rats). By intragastric administration and twice one day, model group rats were given with methionine(1g·kg-1·d-1) and physiological saline(3mL per time) while group C with physiological saline(3mL per time). Six weeks later, the levels of model group rats were all over 16.0 μmol/L. Then model group rats were randomly divided into Hhcy group(H group,eight rats) and vitamin B12group(V group,eight rats). The group H was given with methionine and physiological saline by intragastric administration and twice one day like before while group V was given with methionine(1g·kg-1·d-1) and physiological saline(3mL per time) and folate(0.5mg·kg-1·d-1) and vitamin B12(50μg·kg-1·d-1). Six weeks later, all rats were detected the concentrations of Hcy in plasma and H2S in the plasma and penile tissue. Results：As the levels of plasma Hcy of group C、V and H became higher and higher, the contents of H2S in the plasma and penile tissue correspondingly became lower and lower. There was negative correlation between plasma Hcy and H2S in the corpus cavernosum. Conclusion：Increased levels of plasma Hcy may result in reduction of endogenous H2S, and this may be the reason of reduced erectile function with Hhcy. Folate and vitamin B12could make erectile function better.

Key words:hydrogen sulfide; homocysteine; erectile dysfunction; corpus cavernosum