黄海涛， 丁胜光， 王 飞， 沈 亮， 仲崇俊， 陆晨希

(南通市第一人民医院胸心血管外科，江苏 南通 226001)



·基础研究·

局部应用VEGF-165抑制兔颈移植静脉内膜增生的研究

黄海涛， 丁胜光， 王 飞， 沈 亮， 仲崇俊， 陆晨希

(南通市第一人民医院胸心血管外科，江苏 南通 226001)

目的 探讨局部应用VEGF-165抑制兔颈移植静脉内膜增生的机制。方法 健康家兔24只,均建立颈外静脉-颈总动脉移植模型并分为对照组及实验组。对照组移植静脉周围仅应用Pluronic-F-127，实验组移植静脉周围应用Pluronic-F-127+VEGF-165。观察静脉移植血管外膜、内膜增生情况，移植静脉VEGF及eNOS的表达量，增殖细胞核抗原PCNA表达情况。分析外膜厚度与静脉桥血管内膜增生的关系。结果 与对照组相比，实验组移植静脉内膜增厚明显减轻、而外膜明显增厚，移植静脉eNOS的表达量明显增加；实验组移植静脉平滑肌细胞向外膜方向迁移；术后免疫组化检查显示，实验组移植静脉血管壁内膜VEGF-165的蛋白含量高；两组移植静脉PCNA的表达量未及明显差异。结论 VEGF-165可以通过增加内皮eNOS表达加速移植静脉血管内皮化，促进移植静脉外膜生长促进平滑肌向外膜迁移减轻移植静脉内膜增厚。

动脉旁路移植术； 移植静脉； VEGF-165； 内膜增厚

移植静脉再狭窄是由多种原因造成，包括移植静脉内皮细胞的损伤，外膜滋养血管的破坏，血管壁的缺氧[1]。静脉移植到动脉环境中，静脉血管壁所承受的纵向剪切力和横向管壁张力的变化，启动多种细胞信号通路的参与，最终导致平滑肌细胞的向内膜迁移和增殖导致移植静脉的再狭窄。本研究在移植静脉外膜局部应用VEGF-165，通过药物渗透促进内皮化，同时能够增加移植静脉外膜的厚度，促进平滑肌细胞向外膜迁移，从而减轻内膜增生的程度。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

新西兰大白兔24只(南通大学实验动物中心)，体质量(2.57±0.52)kg,微生物控制级别为Ⅰ级，普通环境中喂养，自由饮水。随机分成对照组和实验组,每组12只。对照组移植静脉血管外周仅喷涂Pluronic-F-127胶膜；Pluronic-F-127+VEGF-165实验组： 移植静脉血管外周喷涂含有VEGF-165(100ng/ml)的Pluronic-F-127胶膜。

1.2 建立自体静脉移植模型

实验兔术前禁食、禁水4h，建立耳缘静脉通道，3%戊巴比妥钠按30mg/kg经耳缘静脉行麻醉。麻醉满意后仰卧位固定，颈部去毛备皮，颈前正中纵行切口，仔细游离、切取颈外静脉一段，肝素-生理盐水冲洗、浸泡。游离右侧颈总动脉，耳缘静脉内注射1%肝素1ml/kg，使其肝素化，阻断颈总动脉近、远段，静脉倒置，采用7-0 prolene线作端-侧间断吻合,约 8～10针，两端吻合完成，缝线收紧前开放动脉夹排气后收紧，然后在两个吻合口之间结扎动脉，确定静脉查无出血后,逐层缝合切口。送回单笼喂养,术后 3d，每日耳缘静脉注射1%肝素1ml/kg 防治血栓，注射青霉素80万U预防感染。手术次日及取标本当日行血管彩色多普勒检查，证实静脉桥通畅。

1.3 取材、切片与染色

术后4周,再予3%异戊巴比妥静脉麻醉，游离静脉移植物，快速、准确切取所需移植物组织，置入10%甲醛中固定24h，组织修整、洗涤，乙醇逐级脱水,二甲苯置换出组织块中酒精，石蜡包埋，切片厚4μm，H-E染色，封片，光镜观察。用Olympus BX50生物显微镜和北航医学图像分析系统进行图像分析,计算血管腔内膜的厚度、面积及外膜的厚度、面积。

1.4 免疫组化检测移植静脉内膜VEGF-165的表达

应用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法(S-P法)，每例取2张连续石蜡切片,二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，微波修复抗原，TBS冲洗后分别滴加VEGF-165抗体。阴性对照用TBS代替一抗，室温孵育60min，TBS缓冲液冲洗，经DAB显色后，苏木精复染，显微镜下观察拍照。

1.5 Western印迹法检测PCNA、eNOS表达量

加入RIPA裂解液，剪碎匀浆，离心半径 8cm，12000r/min，离心10min后，提取总蛋白，Bradford法定量。取蛋白样品，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，半干法转膜，封闭120min，4℃孵育一抗过夜。TBST洗膜，二抗室温摇床孵育120min，HRP-ECL法显色，凝胶成像仪扫描成像，以目的蛋白与β-actin灰度值的比值计算目的蛋白的表达水平，重复多次。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 实验动物手术情况

实验过程中动物无死亡，术后切口无感染，两组移植静脉无闭塞。

2.2 H-E染色切片计算机图像分析

2.2.1 两组移植静脉病理学分析 病理肉眼可见对照组移植物管壁增厚，实验组管壁增厚主要为外膜增厚。光学显微镜下，对照组移植物内膜明显增厚，管腔缩小，内膜下出现大量平滑肌细胞(smoth muscle cell, SMC)增殖，增殖的SMC排列紊乱，细胞周围有较多的胶原纤维,中膜稍有增厚；实验组内膜增厚较对照组减弱,中膜SMC主要向外膜迁移、内下增殖，较对照组明显减轻(图1～2)。

图1 对照组移植静脉H-E染色Fig.1 H-E stain of vein graft in control group

图2 实验组移植静脉H-E染色Fig.2 H-E stain of vein graft in experimental group

2.2.2 移植静脉管壁内、外膜厚度及面积比较 对照组移植静脉内膜明显增厚，内膜面积增大，差异均有统计学意义(P<0.01)；实验组移植静脉外膜较对照组增厚，面积增大，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 两组内膜厚度、面积和外膜厚度、面积比较

与对照组相比，*P<0.01

2.3 免疫组化检测移植静脉内膜的VEGF-165的表达

免疫组化监测结果提示： 对照组移植静脉内膜VEGF-165的表达量少；与对照组相比，实验组移植静脉内膜VEGF-165的表达量明显增加(图3～4)。

图3 对照组移植静脉内膜VEGF-165表达情况Fig.3 Expression of VEGF-165 at vein graft intima in control group

图4 实验组移植静脉内膜VEGF-165表达情况Fig.4 Expression of VEGF-165 at vein graft intima in experimental group

2.4 两组PCNA及eNOS表达量的比较

两组移植静脉PCNA的表达量未见明显差异(P>0.05)；与对照组相比，实验组的eNOS表达量显著增高(P<0.05)，见图5。

图5 两组移植静脉PCNA及eNOS的表达情况Fig.5 Expression of PCNA and eNOS in two groups

3 讨 论

大隐静脉是临床冠脉搭桥手术最常用的桥血管之一，静脉移植动脉环境后容易发生狭窄，这一病理改变严重影响冠状动脉旁路移植术后的远期效果[2]。文献[3]报道，移植静脉10年的通畅率仍不理想，在50%左右。

目前，临床上尚无有效的方法来抑制静脉术后的再狭窄。多种方法在实验研究中用于减轻静脉术后狭窄，如药物干预，包括： 降脂类药物[4]、抗血小板药物[5]、免疫抑制剂[6]；其次，基因转染技术如E2F诱骗物转染移植静脉在小样本研究中发现具有明显的抑制作用，而在大样本研究中并未发现显著的抑制作用[7-8]；此外，血管外支架可抑制移植静脉术后再狭窄，目前研究报道的血管外支架包括可降解的聚乳酸支架[9]、聚四氟乙烯[10]、带药物缓释的血管外支架[11]等。研究发现，带有外支架的移植静脉植入体内后,在支架与移植静脉之间会浸润大量的炎症细胞，主要包括巨噬细胞和巨细胞，这些细胞浸润后会引起炎症反应,同时这些细胞释放出一系列能够影响血管中膜平滑肌细胞(VSMC)增殖迁移、新内膜形成及滋养血管再生的物质如细胞因子和白三烯，其中最主要的即VEGF，VEGF引起VSMC向着外支架方向迁移,而不是向内膜方向移动,从而抑制了新内膜的形成[12-13]。

VEGF-165是目前研究最多的一种VEGF亚型，它具有最强效的促进内皮细胞增殖的能力。转染VEGF-165的成肌细胞能改善心肌梗死区域的血液供应，增加心肌收缩力，改善心功能[14]。动物实验[15-16]证实，VEGF为静脉移植物新生内膜增殖的负性调节介质，其机制主要包括加速损伤血管的再内皮化[17]，增加NO的合成[18]等。

本研究采用带VEGF-165的Pluronic-F-127缓释膜局部作用于移植静脉的外周。结果显示： 实验组移植静脉外周局部使用VEGF-165可以使移植静脉外膜局部形成较高的药物浓度，促进外增厚，增殖的平滑肌细胞向外膜迁移(外膜平滑肌细胞较对照组明显增多)，加上VEGF-165能够增加血管的通透性，渗透入移植静脉内皮细胞部位(免疫组化显示实验组移植静脉内膜处VEGF-165含量明显增加)，促进内皮细胞的修复(eNOS的表达量增加)。同时Pluronic-F-127胶膜本身也可以促进外膜滋养血管的生成，减轻移植静脉的动脉粥样硬化，通过炎症反应，最终引导SMC向血管外膜反向迁移。该胶膜对移植静脉血管壁有一定的支持作用，减轻移植静脉在动脉环境中所承受的应力和剪切力。

免疫抑制剂如雷帕霉素通过抑制SMC的增生可以减轻静脉移植术后的内膜增生狭窄[19]，但最终可能使留下的静脉壁菲薄。由于对治疗后动物模型观察的时间短，是否引起动脉瘤目前尚不清楚。本研究通过外膜SMC聚集增生，最终形成坚厚的血管外壁，而血管管腔不受影响，可能会防止薄壁血管远期的扩张而形成动脉瘤，但远期的效果还需要进一步研究证实。本研究发现VEGF-165应用后SMC的增殖也明显增加，远期中膜及内膜的SMC是否会明显增生。如何精确控制VEGF-165的局部释放形成较好的药物浓度梯度，需要进一步的研究。

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Local application of slow-releasing membrane carrying VEGF-165 inhibits neointima hyperplasia in rabbit vein graft

HUANGHai-tao,DINGSheng-guang,WANGFei,SHENLiang，ZHONGChong-jun，LUChen-xi

(Dept. of Cardiothoracic and Vascular Surgery, Nantong First Peoples Hospital, Nantong 226001, Jiangsu Province， China)

Objective To investigate the effects of local application of VEGF-165 on jugular vein graft in rabbit and its mechanism. Methods Twenty four New Zealand white rabbits were divided into two groups： pluronic F-127 without VEGF-165 was locally applied on the jugular vein graft in control group; and pluronic F-127+VEGF-165 was applied in experimental group. The degree of adventitia and intimal hyperplasia in vein graft were assessed. The expression of VEGF was detected by immunohistochemistry; the expression of eNOS and PCNA was detected by Western Blot. The relationship of the thickness of vein graft adventitia and the degree of intimal hyperplasia was analyzed. Results Compared with control group, the intima hyperplasia was less; the adventitia hyperplasia was greater in experimental group; more SMC moved outwards in experimental group. The western blot test showed that there was no significant difference in the expression of PCNA between two groups; the expression of intimal VEGF and eNOS in experimental group was significantly higher than that in control groups. Conclusion VEGF-165 can increase the activity of eNOS in vein intima and accelerate the endothelialization. VEGF-165 can promote the growth of vein adventitia and attract the smooth muscle cell moving towards outside which contributes to alleviating the intimal hyperplasia.

coronary artery bypass grafting; vein graft; VEGF-165; intimal hyperplasia

10.16118/j.1008-0392.2016.01.008

2015-07-03

南通市科技局社会事业科技创新与示范项目(HS2013050)

黄海涛(1979—)，男，主治医师，博士.E-mail： hht1979@126.com

陆晨希.E-mail： luchenxint@126.com

R 654.3

A

1008-0392(2016)01-0037-05