陈卫华, 龚东魁, 温晓飞, 王跃闽, 茅凯黎, 刘中民

(1. 同济大学附属东方医院泌尿外科，上海 200120； 2. 同济大学东方转化医学研究中心，上海 200120)



·基础研究·

ROCK2在前列腺癌中的表达及意义

陈卫华1, 龚东魁1, 温晓飞1, 王跃闽1, 茅凯黎1, 刘中民2

(1. 同济大学附属东方医院泌尿外科，上海 200120； 2. 同济大学东方转化医学研究中心，上海 200120)

目的 探究ROCK2蛋白在临床局限性前列腺癌患者肿瘤组织内部不同区域的表达水平及其意义。方法 选取2005年1月至2010年12月行前列腺癌根治术的32例临床局限性前列腺癌患者，其中17例生化复发，15例至末次随访无生化复发。收集记录患者的前列腺特异抗原(prostate specific antigen, PSA)水平、Gleason评分、肿瘤分期及是否复发等资料。对这些前列腺根治标本进行免疫组化检测，评估肿瘤中心区、肿瘤前缘区及癌旁前列腺组织中ROCK2的表达水平，分析其与患者血PSA、肿瘤分期、分级及复发的关系。结果 ROCK2在前列腺癌组织肿瘤前缘区表达显著高于肿瘤中心区，且肿瘤前缘区ROCK2高表达与前列腺癌病理分级及生化复发相关，而肿瘤中心区ROCK2表达与前列腺癌病理分级及生化复发无相关。ROCK2表达与患者PSA水平及病理分期均无相关。结论 ROCK2在前列腺癌前缘组织中高表达与肿瘤恶性程度及复发相关，该蛋白可能是前列腺癌的预后因子。

前列腺肿瘤； 肿瘤前缘区； ROCK2蛋白； 生化复发； 病理分级

近年来，随着前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)检测的推广，前列腺癌的发病率显著上升，已成为男性发病率第2位的恶性肿瘤[1- 2]。而前列腺癌有别于其他肿瘤的一个特点在于，对于PSA及后续穿刺结果满足特定条件的低危患者，可以选择主动监测治疗(active surveillance, AS)。Haas等[3]通过尸检发现部分前列腺癌是隐匿存在的，无发展为侵袭性前列腺癌的风险，这类患者同样适用AS治疗。故充分评估肿瘤局部进展和转移的危险性，对于医生优化治疗方案的选择、医疗决策者防止过度医疗及患者提高生活质量均有重要意义。现阶段的评估指标包括PSA、Gleason评分、多参数MRI扫描、阳性活检针数等[4]，但显然无法满足精准医疗的要求。所以对前列腺癌局部进展和远处转移危险性进行研究，找到与之相关的预后因子，以此来指导治疗具有十分重要意义。

ROCK是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，是小GTP结合蛋白Rho的最重要的下游分子，与Rho共同构成Rho/ROCK信号通路，参与调节细胞骨架重组、细胞黏附、细胞迁移侵袭及新生血管形成等，在肿瘤侵袭转移中起重要作用。ROCK有ROCK1和ROCK2两种异构体。卜强等[5]报道，RhoC及ROCK1在前列腺癌组织中高表达，且与肿瘤转移相关。目前，ROCK2在前列腺癌中的表达和意义仍未见报道。此外，在肿瘤组织内部不同区域生物学特性存在差异，相关分子表达也存在差异。因此本实验将对Rho/ROCK通路中的ROCK2蛋白在临床局限性前列腺癌患者肿瘤组织内不同区域及癌旁腺体组织中的表达水平进行研究，并探讨其与疾病预后的相关性。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2005年1月至2010年12月在同济大学附属东方医院泌尿外科就诊的临床局限性前列腺癌患者32例纳入本研究。年龄58～78岁，平均71.3岁，PSA为5.81～27.15ng/ml，平均11.47ng/ml。所有患者均接受了前列腺癌根治手术。根据2009年AJCC的TNM分期系统，对患者前列腺标本进行评估，术后病理T2期16例，T3期16例。术后患者平均随访76(54～126)个月，其中17例术后生化复发，15例至末次随访无生化复发。收集记录这些患者的PSA水平、Gleason评分、肿瘤分期及是否复发等资料。

1.2 免疫组化检测

对收集到的32例临床局限性前列腺癌患者的前列腺根治石蜡块标本进行切片免疫组化检测。选取含有肿瘤密度最高、Gleason评分最高的切片进行检测。切片常规脱蜡，而后在浓度梯度的酒精中水化，然后在96℃的10mmol/L、pH 6.0的枸橼酸钠溶液中加热40min进行抗原修复。分别在羊抗ROCK2多克隆抗体(SC-1851,美国Santa Cruz生物技术公司，浓度1∶50)中4℃孵育过夜，加入生物素化的兔抗羊二抗(BA-5000,美国Vector公司;浓度1∶200)中室温孵育60min。最后与Vectastain Elite ABC试剂盒(PK-7100, 美国Vector公司)反应 30min，用二氨基联苯胺(D4418,美国Sigma公司)显色。切片用苏木精复染后用Permount固定。对每张切片不同区域的ROCK2表达水平进行评分。肿瘤病灶的中心充满肿瘤细胞，称为“肿瘤中心区”，肿瘤边缘与癌旁组织交界处称为“肿瘤前缘区”。同一张病理切片的没有前列腺上皮内瘤变的良性前列腺腺体作为阴性对照，称为“癌旁前列腺组织”。采用半定量的方法对ROCK2的表达进行评估，0表示未见明显染色，1、2、3分别表示轻、中、重度染色。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 ROCK2在前列腺癌前缘区的表达

ROCK2在前列腺癌癌灶不同区域及癌旁组织中的表达情况如图1所示。肿瘤中心区域ROCK2表达水平最低，仅有4例(12.5%)呈高表达，13例(40.6%)呈中等水平表达，余标本ROCK2呈低表达(46.9%)；癌旁前列腺组织中ROCK2表达水平较高，高中低水平表达例数分别为10(31.3%)、12(37.4%)、10(31.3%)；而肿瘤前缘区域表达最高，有16例(50.0%)呈高表达，8例(25.0%)呈中等水平表达，低表达8例(25.0%)。统计结果显示，肿瘤前缘区域的表达水平显著高于肿瘤中心区域，差异有统计学意义(P<0.05)，癌旁前列腺组织ROCK2表达与肿瘤前缘区及肿瘤中心区均无显著差异(P>0.05)。

2.2 前列腺癌前缘区域ROCK2高表达与肿瘤分级及患者预后的关系

在肿瘤前缘区域，病理分级为低分化(GS评分≥4+3)的患者其肿瘤组织中ROCK2的表达显著高于高分化患者(GS评分≤3+4)，差异有统计学意义(P=0.042)；术后出现生化复发的患者肿瘤

前缘区域ROCK2表达水平较未出现生化复发者显著升高，结果有统计学意义(P=0.042)。肿瘤中心区ROCK2表达与前列腺癌病理分级及生化复发无相关(P>0.05)。在肿瘤前缘区和中心区，ROCK2表达水平与患者血PSA浓度、肿瘤分期均无相关性(P>0.05)，见表1。

图1 ROCK2在前列腺癌及癌旁组织中的表达Fig.1 The ROCK2 expression in the prostate cancer and peritumoral prostate tissueA： ROCK2在肿瘤组织内部表达的总体情况(×50)；B： ROCK2在肿瘤前缘区表达(×400)；C： ROCK2在肿瘤中心区表达(×400)；D： ROCK2在癌旁前列腺组织表达(×400)；E： 肿瘤前缘区与肿瘤中心区的表达(×400)

区域肿瘤表达n肿瘤分期低分期高分期P值病理分级高分化低分化P值复发是否P值PSA/(ng·ml-1)P值肿瘤前缘区低844622612.46±6.74中8350.670440.042*440.042*11.22±7.120.919高169751111511.09±6.23肿瘤中心区低1578698712.83±7.65中13670.442670.268760.93610.51±6.120.827高431312211.26±6.84

肿瘤分期使用2009年AJCC的TNM系统，低分期为T1、T2，高分期为T3、T4；病理分级使用Gleason评分系统，低分化的GS评分≥4+3，高分化的GS评分≤3+4；*P<0.05

3 讨 论

研究发现，Rho/ROCK信号通路参与肿瘤细胞的侵袭转移，而ROCK2是Rho/ROCK信号通路中的关键分子。肿瘤细胞侵袭是一个多步骤的复杂过程，其中肌动蛋白依赖的应力纤维收缩是肿瘤细胞迁移前进的驱动力量来源[6]。ROCK2可通过多种途径增加肌球蛋白轻链磷酸化，促进应力纤维聚合和收缩，增强肿瘤细胞运动，有利于肿瘤细胞侵袭转移，包括： (1) 间接通过调节肌球蛋白磷酸酶的作用亚基(MYPT1)磷酸化，增加肌球蛋白轻链磷酸化，从而使肌动球蛋白发生收缩[7]；(2) 通过直接磷酸化肌球蛋白轻链,使肌球蛋白和肌动球蛋白收缩力增强[8]；(3) 通过激活LIMK(单丝氨酸蛋白激酶)，使Cofilin(G肌动蛋白结合蛋白，为肌动蛋白丝解聚所必需)磷酸化失活，从而抑制肌动蛋白丝的解聚，实现细胞前缘伪足形成和延伸[9]；(4) 磷酸化内收蛋白，进而促进细胞边缘波动和细胞移动；(5) 促进局部粘着斑形成与微丝介导的细胞运动，进而调节肿瘤细胞的转移；(6) 通过肌动球蛋白收缩来调节细胞骨架重组，使肿瘤细胞运动能力增强，促使肿瘤细胞在细胞外基质(ECM)中的迁移[10]。

已有研究证实，ROCK2在肿瘤组织中表达升高且与侵袭转移过程相关。ROCK2在肝癌组织中过表达，能调节组织中MMP2的活性，使其活性增高，促进细胞间质降解，从而促进肿瘤转移[11]；宫颈癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌中ROCK2表达显著升高，与病理组织分级及淋巴结转移相关[12]。在前列腺癌中，卜强等[5]报道RhoC及ROCK1在前列腺癌组织中高表达，且与肿瘤转移相关。但到目前为止，ROCK2在前列腺癌中的表达和临床意义未见报道，故我们将研究方向定于此。

肿瘤微环境是高度复杂且具有不均一性，已有文献报道肿瘤前缘区和肿瘤中心区的生物学特性存在差异，如在结肠癌中，肿瘤前缘区域的肿瘤细胞比肿瘤中心区域的细胞具有更强的侵袭性[13]。本研究设想在前列腺癌中肿瘤前缘区和肿瘤中心区亦存在不同的生物学特性，故对ROCK2蛋白在前列腺癌患者肿瘤组织内部不同区域的表达水平也分别进行了评估。

本研究结果显示： ROCK2在肿瘤前缘区域表达明显高于肿瘤中心区域，而且前列腺癌前缘区域ROCK2高表达与肿瘤分级及复发相关，而肿瘤中心区域ROCK2表达与肿瘤分级及复发不相关，提示肿瘤前缘区肿瘤细胞有较高的侵袭特性，这部分肿瘤细胞更能代表肿瘤总体的生物学特性，进一步证实了研究肿瘤不同区域生物学特性差异的重要性，同时也为进一步细化前列腺癌的研究及精确取标本用于后续基因或蛋白芯片等高通量研究提供理论依据，避免结果的偏倚。

由于ROCK2是机体细胞普遍存在的信号调节分子，功能复杂多样，参与细胞内转运等功能，在前列腺腺体正常功能中起一定的作用。本研究也发现ROCK2在癌旁组织中亦有中等程度表达，表达水平介于肿瘤前缘区与肿瘤中心区域之间，与两者均无显著差异。考虑到ROCK2在肿瘤组织及癌旁组织中表达所起细胞功能上的差异，直接比较它们之间的表达差异可能是没有意义的。

由于本研究的样本量较小，研究结果可能存在一定的偏倚，需在后续实验中进一步扩大样本量，延长患者随访时间来明确证实本研究的研究结果。另一方面，本研究仅选择了前列腺癌标本中级别最高的代表性病灶进行研究，这也可能造成结果不够全面，在后续研究中对前列腺癌整个腺体进行切片和分析将有利于更全面的了解Rho/ROCK通路在前列腺癌疾病进展中的意义。

本研究在临床局限性前列腺癌患者标本中检测ROCK2表达，发现ROCK2在前列腺癌前缘区域高表达，与前列腺癌生化复发及肿瘤恶性程度相关，提示该蛋白可能成为前列腺癌的预后因子，在前列腺癌中进展中可能起重要作用，为进一步研究该通路在前列腺癌中的作用机制及干预该通路治疗前列腺癌提供理论依据。

[1] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer Journal Clin, 2012,62(1)： 10-29.

[2] 唐志柳，白洁，顾丽娜，等.2000～2010年我国前列腺癌和乳腺癌流行状况的系统性综述[J].中国肿瘤，2013，22(4)： 260-265.

[3] Haas GP, Delongchamps NB, Jones RF, et al. Needle biopsies on autopsy prostates： sensitivity of cancer detection based on true prevalence[J]. Nat Cancer Inst, 2007,99(19)： 1484-1489.

[4] 李培，吴蓉，吴剑，等.经会阴前列腺穿刺针数与体积关系探讨[J].同济大学学报： 医学版，2015,36(3)： 79-82.

[5] 卜强，汤华明，谈健，等.前列腺癌中RhoC和Rho激酶1的表达及其对丝裂原活化蛋白激酶和Akt蛋白的影响[J].中华肿瘤杂志，2011,33(3)： 202-206.

[6] Fackler OT， Grosse R. Cell motility through plasma membrane blebbing[J]. J Cell Biol, 2008,181(6)： 879-884.

[7] Liao JK, Seto M, Noma K. Rho kinase (ROCK) inhibitors[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2007,50(1)： 17-24.

[8] Gutjahr MC, Rossy J, Niggli V. Role of Rho, Rac, and Rho-kinase in phosphorylation of myosin light chain, development of polarity, and spontaneous migration of Walker 256 carcinosarcoma cells[J]. Exp Cell Res, 2005,308(2)： 422-438.

[9] Fiedler SE, Bajpai M, Carr DW. Identification and characterization of RHOA-interacting proteins in bovine spermatozoa[J]. Biol Reprod, 2008,78(1)： 184-192.

[10] Goetsch P, Snyman C, Myburgh KH, et al. ROCK-2 is associated with focal adhesion maturation during myoblast migration[J]. J Cell Biochem, 2014,115(7)： 1299-1307.

[11] Huang D, Du X, Yuan R, et al. Rock2 promotes the invasion and metastasis of hepatocellular carcinoma by modifying MMP2 ubiquitination and degradation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014,453(1)： 49-56.

[12] 顾颖，张晔.RhoA/ROCK2信号通路在宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌组织中的临床意义[J].南京医科大学学报，2012(3)： 386-390.

[13] Delongchamps NB, Beuvon F, Mathieu JR, et al. CXCR4 is highly expressed at the tumor front but not in the center of prostate cancers[J]. World J Urology, 2015,33(2)： 281-287.

Expressions of ROCK2 in clinically localized prostate cancer and its clinical significance

CHENWei-hua1,GONGDong-kui1,WENXiao-fei1,WANGYue-min1,MAOKai-li1,LIUZhong-min2

(1. Dept. of Urology, East Hospital, Tongji University, Shanghai 200120, China；2. Research center for translation medicine, East Hospital， Tongji University, Shanghai 200120, China)

Objective To investigate the expressions and clinical significance of ROCK2 in clinically localized prostate cancer. Methods The tissue specimens were obtained from 32 patients with clinically localized prostate cancer receiving radical prostatectomy in Shanghai East Hospital from January 2005 to December 2010. Among 32 cases, 17 relapsed and 15 cases had no relapse until the last follow-up. The clinical data of these patients, including PSA level, Gleason score, tumor stage and biochemical relapse were recorded. The expressions of ROCK2 were assessed by immun-ohistochemical staining in different area on tissue sections, including tumor centre, tumor front and distant peritumoural tissue. Differences of the expressions in these area and their associations with the clinical features and outcome of the patients were analyzed. Results ROCK2 expression in tumors front was significantly higher than those in the tumor centre. The high expression of ROCK2 in tumor front was associated with the pathological grade and biochemical relapse, but ROCK2 expression in tumor center was not. ROCK2 expressions had no association with serum PSA level and pathological stage. Conclusion The high ROCK2 expression in tumors front is related to tumor malignancy and biochemical relapse, suggesting that ROCK2 may be a prognostic factor for prostate cancer.

prostate tumor; tumor front; ROCK2 protein; biochemical relapse; pathological stage

10.16118/j.1008-0392.2016.01.004

2015-11-25

国家国际科技合作专项(2012DFG31440)

陈卫华(1977—)，男，主治医师，博士.E-mail： drchenweihua@126.com

刘中民.E-mail： zhongmin_liu@163.com

R 737.25

A

1008-0392(2016)01-0018-04