范文斌, 张介平, 王 娟, 吕立夏, 徐国彤

(1. 同济大学医学院眼科研究所，上海 200092； 2. 同济大学医学院再生医学系，上海 200092；3. 同济大学医学院干细胞研究中心，上海 200092)



·基础研究·

miR-124对Müller细胞转分化机制的影响

范文斌1，2，3, 张介平1，2，3, 王 娟1，2，3, 吕立夏1，2，3, 徐国彤1，2，3

(1. 同济大学医学院眼科研究所，上海 200092； 2. 同济大学医学院再生医学系，上海 200092；3. 同济大学医学院干细胞研究中心，上海 200092)

目的 探讨过表达miR-124对Müller细胞转分化机制的影响。方法 构建pSuper-EGFP-miR-124质粒并测序验证，获得miR-124的过表达载体。并用其转染Müller细胞系，用G418进行筛选，获得Müller细胞稳转株，将样本送基因芯片检测。利用TargetScan和miRBase Targets数据库预测差异表达明显的miR-124靶基因，通过Real-Time PCR和荧光素酶活性测定实验验证分析miR-124的靶基因，筛选变化比较显著的基因进一步研究。miR-124转染Müller细胞，提取mRNA和蛋白，采用Real-Time PCR、Western印迹法检测相关基因的变化。结果 成功构建pSuper-EGFP-miR-124质粒并获得了稳定转染的Müller细胞系。荧光素酶报告分析表明，miR-124与STAT3 3′UTR相互作用。体外结果显示，pSuper-miR124转染Müller细胞后，STAT3表达下降并开始表达光感受器细胞标志物CRX和RCVRN。结论 miR-124可能通过下调STAT3，上调CRX和RECVN，诱导Müller细胞向感光细胞转分化。

miR-124； STAT3； Müller细胞； 转分化

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中，长度为21～23个碱基的内源性非编码单链小RNA。共有78种miRNA在成年小鼠的视网膜中表达，其中21种是视网膜特有的，以维持视网膜功能[1-3]。

miR-124在线虫体内的许多感觉神经元中表达[4]，可诱导胚胎干细胞分化为神经细胞，与转录因子STAT[5-6]一起调控神经元和胶质细胞的比例[7-8]。因此，miR-124可能与特定的靶分子结合对哺乳动物视网膜起到多效性的保护作用[9]。

Müller细胞是视网膜中重要胶质细胞，对视网膜神经元起着支持和营养的作用，同时还参与维持视网膜神经细胞的新陈代谢内环境的稳态[10-11]。Müller细胞可能是一种晚期视网膜祖细胞，具有分化、增殖并转分化为视网膜神经细胞的潜能[12-13]。

本研究采用过表达miR-124的Müller细胞作为细胞模型，在基因芯片结果的基础上，经TargetScan、miRBase Targets数据库预测及荧光素酶报告基因分析，采用qPCR和Western B印迹法鉴定miR-124调控Müller细胞靶基因的关键分子及其在视网膜变性早期发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 构建pSuper-EGFP-miR-124质粒

miR-124前体扩增引物的设计： 检索Sanger miRNA数据库(http：//microrna.sanger.ac.uk/sequences)，获得miR-124前体序列。利用primer3在线引物设计软件(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/)，根据拟插入pSuper质粒的酶切位点(BglⅡ/HindⅢ)设计合成扩增miR-124前体片段的引物，连接转化大肠杆菌并测序鉴定。

1.2 转染pSuper-EGFP-miR-124至Müller细胞系

Müller细胞培养基为含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM/F12培养基，置37℃、5%CO2培养箱培养。常规培养Müller细胞于24孔板中，至细胞密度达80%铺满时，分5个浓度组加入含G418的培养液1ml/孔(G418用双蒸水配制后过滤除菌，终浓度分别为0、250、500、750、1000μg/ml)，换液时保持G418浓度稳定不变，持续培养12d。选取在筛选12d能完全杀死所有Müller细胞的最小G418浓度作为最佳筛选浓度。

将Müller细胞铺于24孔板，待细胞长至孔板底面积80%左右时，利用脂质体LipofectamineTM2000将pSuper-miR-124重组质粒转入Müller细胞。细胞转染48h后，荧光显微镜观察转染效率，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基筛选，最后获得单克隆稳定生长的Müller细胞株。收集活细胞样本，做基因芯片。

1.3 结合芯片结果预测差异表达明显的miR-124的靶基因

结合过表达miR-124的Müller细胞系的DNA芯片结果，利用TargetScan(http：//genes.mit.edu/targetscan.test/ucsc.html)和miRBase Targets(http：//cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirna-viewer.pl)数据库预测miR-124靶基因。

1.4 Real-Time PCR验证miR-124的靶基因芯片

收集G418筛选的miR-124稳转Müller细胞系，加入TRIzol抽提总RNA，采用反转录试剂盒(TaKaRa公司)完成反转录。将cDNA稀释至10ng/μl，用于定量PCR。采用ΔΔCt=ΔCt处理组-ΔCt对照组的方法计算靶基因的表达量。

1.5 psiCHECK-2-STAT3 3′UTR双荧光素酶重组载体的构建

以Müller细胞系RNA为模板进行反转录得到cDNA，设计rno-STAT3 3′UTR引物，以反转录后产物为模板进行PCR扩增，程序： 94℃ 10s，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，35个循环。然后电泳，目的片段90nt，割胶回收(天根DNA纯化回收试剂盒)，过柱纯化。将纯化产物与psiCHECK-2质粒(C8021，Promega公司)同时用NotⅠ和XhoⅠ酶切，经凝胶电泳分离、凝胶回收试剂盒回收目的片段并连接。将连接产物转化感受态大肠杆菌，挑选转化阳性克隆接种培养，取菌液用小量法提取质粒，用NotⅠ和XhoⅠ进行双酶切，电泳分析酶切片段并送测序鉴定，将测序结果正确的质粒保种，浓度为300ng/μl。

1.6 Western印迹法

细胞转染miR-124后刮取细胞，加入RIPA缓冲液(含10mg/ml PMSF)50l，冰上孵育30min，用BCA试剂盒测定细胞总蛋白浓度。30μg总蛋白样品电泳，分离，转膜，抗体孵育，化学发光显色。采用β-actin作为内参。

1.7 免疫荧光组织化学染色

细胞爬片用PBS漂洗2次，在24孔板内加入4%多聚甲醛，室温固定10～15min，PBS漂洗，0.3%Triton X-100的PBS透膜，5%BSA的PBS封闭。一抗孵育： 一抗按适当滴度稀释在含5%BSA的PBS中，将一抗加入24孔板，4℃过夜，一抗分别为： GS(1∶200)，Vimentin(1∶200)，GFAP(1∶500)，STAT3(1∶200)，RCVRN(1∶200)，CRX(1∶200)；PBS漂洗3次。二抗孵育： 避光，加入相应一抗来源的按比例稀释的荧光素标记二抗，室温孵育60min，二抗分别为Cy3标记山羊抗兔IgG(1∶500)，Cy3标记山羊抗小鼠IgG(1∶500)；PBS漂洗3次，每次10min；0.5mg/ml DAPI(PBS配制)染细胞核3min，PBS漂洗3次，每次10min；取载玻片，滴少量DAKO，荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察。

1.8 细胞转染及荧光素酶活性检测

将报告基因质粒与pSuper-miR-124共转染HEK293细胞，在转染前1d，接种293细胞到24孔板，在正常条件下培养至80%汇合率时转染，LipofectamineTM2000脂质体共转pSuper-miR-124和Psicheck-STAT3-3UTR后36h，进行荧光素酶活性分析。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 pSuper-EGFP-miR-124重组质粒的构建

检索Sanger miRNA数据库(http：//microrna.sanger.ac.uk/sequences)，获得miR-124前体序列，并于NCBI数据库检索miR-124前体序列基因组定位及序列。利用primer3在线引物设计软件(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/)，根据拟插入pSuper质粒的酶切位点(BglⅢ/HindⅢ)设计合成扩增miR-124。

2.2 pSuper-EGFP-miR-124稳定转染的Müller细胞株的构建

选取在筛选12d充分杀死所有Müller细胞的最小G418浓度(500μg/ml)作为最佳筛选浓度。细胞转染48h后，荧光显微镜下观察转染效率，绿色荧光的细胞数约占70%(图1A、图1B)。绿色荧光的细胞为表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的细胞，提示该转染条件下能够保证外源基因高效率地进入Müller细胞。G418筛选2周后，Müller细胞均发出较为明亮的绿色荧光(图1C、图1D)，通过提取细胞mRNA进行检测，进一步验证了筛选得到的Müller细胞株稳定表达了miR-124基因(图2A)，提示稳定表达pSuper-miR-124的Müller细胞株成功获得。

2.3 miR-124靶基因的分析及验证

miRBase Targets分析显示，miR-124的靶基因有727个；TargetScan 分析显示，miR-124的靶基因共有1104个。miRBase Targets和TargetScan分析中miR-124共有的靶基因有233个。根据前期miR-124在Müller细胞中过表达的芯片结果，本研究选定STAT3作为进一步重点研究的对象。经 RT-PCR 验证，与芯片结果一致(图2A、图2B)。同时，Western印迹法也验证miR-124对STAT3有负调控作用(图2C、图2D)。

2.4 荧光素酶活性分析

与pSuper-miR-124共转染时，psiCHECK-2-STAT3 3′UTR共转染组荧光比率较psiCHECKTM-2空载体对照组都有明显下降，抑制率可以达到40%，两组抑制作用差异有统计学意义(P<0.05)。而当psiCHECK-2-STAT3 3′UTR和psiCHECKTM-2与pSuper空载体共转染时，两组间荧光比率差异无统计学意义，说明STAT3的3′-UTR能与miR-124相互作用，抑制海肾荧光素酶的活性(图3)。因此，STAT3是miR-124的直接靶基因(P<0.05)。

2.5 构建psiCHECK-2-STAT3 3′UTR双荧光素酶重组载体

与未转染miR124的Müller细胞相比，转染miR-124后细胞的RECVN的mRNA水平显著上调，(P<0.05)。由于RECVN是感光细胞的高表达基因，故本结果提示转染了miR-124 Müller细胞可能已发生向光感受器细胞的转分化(图4)。

图1 稳定转染pSuper-EGFP-miR-124的Müller细胞的筛选(标尺： 20μm)Fig.1 Transfection of miR-124 into Müller cells and screening(scale bar： 20μm)A、B： Müller细胞转染pSuper-EGFP-miR-124后48h；C、D： Müller细胞转染pSuper-EGFP-miR-124后G418筛选2周；A、C为明场；绿色表示GFP

图2 Müller细胞中过表达miR-124对STAT3的影响Fig.2 Effect of miR-124 overexpression on STAT3 in Müller cellsA： miR-124表达水平；B： STAT3的mRNA水平；C： STAT3和p-STAT3的蛋白水平；D： 蛋白表达的灰度分析

图3 miR-124与STAT3 3′UTR相互作用Fig.3 The interaction between miR-124 and 3′UTR of STAT3

图4 RT-PCR检测Müller细胞中Recoverin表达Fig.4 RT-PCR analysis of Recoverin expression in Müller cells

3 讨 论

本研究通过miR-124转染Müller细胞，鉴定miR-124能够靶向STAT3基因，从而上调RECVN基因的表达。

研究[14-15]发现，在小鼠的脑组织和由P19多能干细胞分化而来的神经样细胞中miR-124被特异性地高表达，提示miR-124可能与神经细胞的分化相关[16]。miR-124的一个靶基因是多聚嘧啶序列结合蛋白(PTB)的编码基因，PTB是一种选择性剪切的调控蛋白，它能阻止选择性外显子的接入[17]。在神经发育分化过程中，PTB和神经元PTB(nPTB)的表达转换，导致了神经元重要功能基因的剪切模式的变化，PTB能改变nPTB的剪切方式，使nPTB蛋白的翻译提前终止，从而不能得到成熟的nPTB蛋白[18]。而miR-124通过直接抑制PTB蛋白的表达，而间接激活了nPTB的表达，从而促进细胞向神经元方向分化。

研究[19]表明，miR-124能直接抑制羧基端小结构域磷酸酶1(SCP1)，而SCP1是REST发挥抑制神经元基因表达的必需成分，因此miR-124能间接地抑制REST的活性[20-21]。这表明存在一种负反馈机制： 在非神经元细胞和神经元前体细胞中，神经元特异性基因(包括miR-124)的表达是被REST和SCP1抑制的，随着细胞向神经元方向分化以及REST受转录抑制，miR-124通过在转录后水平抑制REST的辅助因子SCP1的表达而快速终止REST的生物功能。

以上的研究均提示，miR-124可能通过靶向PTB及SCP1等靶基因，而间接促进神经元基因表达，使细胞向神经元方向分化，这也是本研究在视网膜胶质细胞(Müller细胞)中过表达miR-124并检测视网膜神经元特异基因改变的主要原因之一。

Müller细胞作为视网膜中极为重要的胶质细胞，具有分化、增殖并转分化为视网膜神经细胞的潜能。本研究利用miRBase Targets和TargetScan分析miR-124的靶基因并鉴定STAT3为miR-124靶基因。STAT3是一种潜在的细胞质中固有的被JAK激酶磷酸化调节的转录因子，JAK/STAT是重要的细胞内信号转导通路，调控细胞生长、分化和凋亡等重要过程。研究[22-25]报道，IL-6会导致视网膜STAT3活化[22]，并进一步影响视觉功能[23-25]： 如视紫红质蛋白水平的降低和光感受器外节的缩短。暗视视网膜电图的a波的振幅也减小等。此外，还有文献指出，STAT3的激活会导致视紫红质的泛素化和迅速降解，这一结论已经在体外实验中得到了验证。应用JKA的抑制剂抑制IL-6介导的STAT3的激活，可以阻止视紫红质的降解，进而保护视功能[24，26]。

在给予AAV2/8-EGFP-miR-124处理后，处理组STAT3的表达被抑制，而RCVN的表达量显著上升。该结果进一步提示了在视网膜Müller细胞中miR-124与STAT3的密切关系，RCVN的上升预示着Müller细胞很有可能已经开始向视网膜神经细胞转分化。miR-124对Müller细胞具体的转分化机制还有待于进一步研究。从目前这些数据结果来看，抑制STAT3通路在Müller细胞转分化成神经细胞过程中起到了十分重要的作用。通过对miR-124功能的进一步探索，发现其参与调节了细胞内信号通路的转导，因此，通过过表达miR-124靶向抑制STAT3的表达从而干预Müller细胞转分化过程，促进神经细胞再生可能成为视网膜退行性疾病治疗的新方法。

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Mechanisms of miR-124-induced transdifferentiation in Müller cells

FANWen-bin1，2，3,ZHANGJie-ping1，2，3,WANGJuan1，2，3,LVLi-xia1，2，3,XUGuo-tong1，2，3

(1. Tongji Eye Institute, Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China;2. Dept. of Regenerative Medicine, Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China;3. Stem Cell Research Center, Medical College, Tongji University, Shanghai 200092, China)

Objective To investigate the mechanism of miR-124-induced transdifferentiation in Müller cells. Methods The pSuper-EGFP-miR-124 plasmid was constructed and sequenced, then transfected in Müller cells and verified by microarray analysis. miR-124 target genes were predicted with the combination of DNA microarray analysis, TargetScan and miRBase Targets databases. Real-time PCR and luciferase were employed to verify those target genes, and the differentially expressed genes were picked up for future study. The changes of related genes were detected by Real-time PCR and western blot in pSuper-miR-124 transfected Müller cells. Results pSuper-EGFP-miR-124 plasmid was cloned and sequenced, its sequence was confirmed. The stable transfected Müller cells were obtained under the selection of G418. Based on the results of microarray analysis, differentially expressed genes of interest were verified, especially STAT3 which showed significant trend. It showed that miR-124 regulated expression of STAT3 by directly targeting its 3′-UTR, and inhibition of STAT3 activation increased the expression of photoreceptor cell markers CRX and RCVRN in cultured Müller cells. Conclusion The miR-124 targets STAT3 to up-regulate CRX and RCVRN expression in Müller cells, which suggests that miR-124 may induce transdifferentiation of Müller cells to photoreceptor. It can be speculated that miR-124 could protect against retinal degeneration via inhibition of Müller cell gliosis and induction of Müller cell transdifferentiation.

miR-124; STAT3; Müller cell; transdifferentiation

10.16118/j.1008-0392.2016.01.001

2015-06-09

国家“九七三”重点基础研究发展计划(2013CB967501)

范文斌(1989—)，女，硕士研究生.E-mail： fanwenbing.1@163.com

徐国彤.E-mail： gtxu@tongji.edu.cn

R 774.1

A

1008-0392(2016)01-0001-06