史子学，赵晓明，唐赛涌，曹传闺，肖耀明，庄建萍，卞 益，朱校俊，费琼慧（.上海市嘉定区农业委员会，上海 嘉定 0800；.上海市嘉定区动物疫病预防控制中心，上海 嘉定 0800）



应用ISSR-PCR技术鉴别梅山猪肉及其肉制品的研究

史子学1，赵晓明2，唐赛涌2，曹传闺2，肖耀明2，庄建萍2，卞 益2，朱校俊2，费琼慧1
（1.上海市嘉定区农业委员会，上海 嘉定 201800；2.上海市嘉定区动物疫病预防控制中心，上海 嘉定 201800）

摘 要：为解决涉及梅山猪及其肉制品的假冒销售纠纷，有效保护梅山猪地方品种的市场地位和品牌形象，研究了ISSR-PCR方法鉴别梅山猪及其肉制品的引物及其方法，通过比较PCR指纹图谱，能特异性鉴别梅山猪肉。

关键词：ISSR-PCR；梅山猪肉；鉴别；指纹图谱

梅山猪原产于太湖流域的上海市嘉定、宝山、松江等区县和江苏的昆山、太仓等市县，是太湖猪中的典型代表，有肉质好、耐粗饲、抗病力强等优良特性。嘉定区的梅山猪品种其肌肉鲜嫩、肌纤维细而密，含水量较少，肌内脂肪丰富，呈大理石状，俗称“五花肉”［1，2］。近年来随着人们生活水平的提高，对畜禽产品的质量要求越来越高，许多以追求高产为目的培育的外三元猪肉不能满足消费需求，取而代之的是猪肉市场消费追求多样化、精细化、肉质高品质化。梅山猪因肉质鲜美、香甜浓香而受到上海市民青睐，尽管价格比较高却供不应求。目前尚没有鉴定梅山猪肉及其肉制品的方法可以有效地保护正宗梅山猪肉及其肉制品的市场地位和品牌形象。

目前，制定的以活体猪为检测对象的鉴别梅山猪的地方性标准，对梅山猪宰杀后分割肉及其他肉制品就不能用这种标准进行鉴定了。猪全基因组测序技术虽然可以鉴别不同品种、甚至不同个体的猪，但需要检测的基因数目很多，成本大，不能广泛应用。而若只检测不同品种猪的个别基因，则不能区分转基因和纯种猪肉制品。ISSR是Zietkiewicz等［3］于1994创建的一类在PCR反应基础上的DNA分子标记技术，它和PCR技术联合使用具有很高的特异性和灵敏度且准确快速，近年来在品种鉴定、种质资源和遗传多样性研究广泛应用，如ISSR分子技术鉴别陆川猪肉［4］、雁鹅［5］、马铃薯［6］、霍乱弧菌［7］和水稻［8］品种等。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

梅山猪、梅杜二元杂猪样品来源于上海市嘉定区梅山猪育种中心（国家级梅山猪保种场）；杜长大三元杂猪肉样品购自乐购超市；金华两头乌猪肉样品购自专卖店；宁乡花猪样品购自湖南景仓农业科技有限公司（宁乡花猪专卖店）；苏淮黑猪样品购自江苏省苏食肉品有限公司（苏淮黑猪专卖店）；陆川猪样品购自广西玉林陆川猪养殖户；羊肉、牛肉购自乐购超市。样品分装后，-20 ℃保存备用。

ISSR随机引物根据British Columbia大学公布的序列设计，2×Taq PCR MasterMix购自天根生化科技有限公司，其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器

凝胶成像系统（Bio-Rad）；PCR扩增仪（ABI）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf）；DYY-7型电泳仪（北京市六一仪器厂）等。

2 方法

2.1 基因组DNA提取

分别取约100 mg梅山猪母猪、梅杜二元杂母猪、梅山猪公猪、梅杜二元杂公猪、杜长大三元杂的生鲜肉，放入研磨器加1 000μL蒸馏水，研磨5 min，取100 μL研磨液，加入1 mLDNA提取缓冲液（10 mol/ L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.5%SDS），然后再加入25 μL蛋白酶K，使终浓度达到100 μg/mL，混匀，50 ℃水浴3 h。用等体积的酚抽提1次，2 500 r/min离心收集水相，用等体积的酚、氯仿和异戊醇（体积比25：24：1）的混合物抽提1次，2 500 r/min离心收集水相；用等体积的氯仿和异戊醇（体积比24：1）的混合物抽提1次；加入等体积的5 mol/L的LiCl，混匀，冰浴10 min；2 500 r/min，离心10 min。转移上清加入等体积的异丙醇，室温10 min；2 500 r/min，离心10 min后弃上清。加入0.1倍体积3 mol/L乙酸钠（pH5.2）与2倍体积-20℃预冷无水乙醇，-20 ℃静置20 min。室温12 000 r/min离心5 min后弃上清。将基因组DNA溶于适量100 μL TE中，作为ISSR-PCR反应的模板DNA。

2.2 ISSR-PCR反应体系与扩增程序

ISSR-PCR反应体系为25 μL体系：模板DNA 1μL、引物0.4 μmol/L、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O补足25 μL；扩增程序：设置梯度PCR扩增程序。95 ℃预变性 2 min，95 ℃变性30 s，退火30s，72℃延伸1 min，循环40次，72 ℃再延伸10 min。

2.3 电泳检测

将扩增产物5μL进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳，1×TAE缓冲液，电压100 V下电泳0.5 h，凝胶成像系统拍照。

3 结果与分析

3.1 供试样品ISSR-PCR扩增结果

选择ISSR随机引物：5’-ATG ATGATGATGATGATGA-3’，经梯度PCR优化确定的退火温度为54.6℃，模板加入量50～100 mg。对梅山猪母猪、梅杜二元杂母猪、梅山猪公猪、梅杜二元杂公猪、杜长大三元杂的生鲜肉提取基因组DNA进行ISSR-PCR扩增，电泳图谱见图1。对梅山猪母猪、金华两头乌、苏淮黑猪、宁乡花猪、陆川猪、羊肉、牛肉提取的基因组DNA进行ISSR-PCR扩增，电泳图谱见图2。

3.2 扩增条带图谱分析

如图1中箭头所示，梅杜二元杂母猪、梅杜二元杂公猪、杜长大三元杂样品均产生1条较清晰的条带，而梅山猪母猪、梅山猪公猪中无此条带，多次重复实验结果一致，并且梅山猪母猪、梅山猪公猪样品PCR扩增条带一致。梅山猪有条带A、B、D、E和F而无条带B1和C，而梅杜二元杂和杜长大三元杂有条带A、B、C、D，条带E和F稍模糊，梅杜二元杂母猪、杜长大三元杂有清晰B1条带杜梅二元杂公猪B1条带稍模糊。因此，凡是满足有且仅有条带A、B、D、E和F即可鉴定为梅山猪。

图1 鉴定梅山猪的电泳图谱

图2 鉴别梅山猪与其他品种猪及羊肉、牛肉电泳图谱

如图2中箭头所示，金华两头乌、苏淮黑猪、宁乡花猪、陆川猪样品均产生一条较清晰的条带（B1带，大小为850 bp），而梅山猪中无此条带，多次重复实验结果一致，羊肉、牛肉与猪肉图谱差异较大，很容易区分。由图2发现，梅山猪有条带A、B、D、E和F而无条带B1和C，而金华两头乌猪、苏淮黑猪、宁乡花猪、陆川猪有清晰条带A、B1、D、E和F，陆川猪还有明显的C带。而羊肉与牛肉的DNA指纹图谱与梅山猪相去甚远，羊肉具有明显的条带C，而牛肉具有极为明亮明显的条带B1。因此，凡是满足有且仅有条带A、B、D、E和F的样品可鉴定为梅山猪。

4 讨论

ISSR-PCR主要是由单一引物且以重复序列为扩增序列，所以结果的特异性受引物序列、反应体系或退火温度等影响较大。本研究经优化建立了基于ISSR-PCR技术梅山猪肉鉴别方法，图谱扩增带明亮、稳定性及多态性高，为梅山猪遗传保种、商业化推广提供了技术手段，也为国内其他优良地方猪肉品种辨别提供了借鉴。

参考文献

［1］ 殷方芝，肖耀明，陶军，等. 近年来我国地方猪种遗传资源保护与利用［J］. 猪业科学， 2015，32（10）：132-133.

［2］ 唐赛涌，王勃，陆林根.上海地区梅山猪的历史发展与保种现状［J］.中国猪业，2013 （S1）：71-73.

［3］ Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprintingby simple sequence repeat（SSR） anchored polymerase chainreaction amplification［J］. Genonics，1994， 20（2）：176-183.

［4］ 何瑜林，黄丽，封毅，等.ISSR分子标记鉴定陆川猪及其肉制品［J］. 肉类研究，2014，28 （10）：10-14.

［5］ 李莹，梁强，赵华宝，等.雁鹅遗传多样性的ISSR分析［J］.农业生物技术学报， 2009 （6）：63-68.

［6］ 段艳凤，刘杰，卞春松，等.中国88个马铃薯审定品种SSR指纹图谱构建与遗传多样性分析［J］.作物学报，2009，35（8）：1 451-1 457.

［7］ 莫秋华，谭华，王琪，等.霍乱弧菌分子分型和溯源技术ISSR-PCR的改进［J］.中国病原生物学杂志，2014 （9）：33-37.

［8］ 黄亮，李雨馨.常见水稻品种的DNA指纹图谱构建及其遗传［J］.粮食与油脂.2014 （10）：29-32.

收稿日期：（2016-01-28）