郭振华，乔松林（河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002）



酶联免疫吸附技术在规模化猪场的应用

郭振华，乔松林
（河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002）

摘 要：血清学检测在疫苗免疫效果评估、疫病诊断监测、猪群健康评估等方面发挥着重要的作用，其中酶联免疫吸附试验（ELISA）检测技术因其具有操作简便、快速敏感和易于标准化等优点，使其得到快速发展和广泛应用。目前ELISA检测技术在养猪生产中已得到广泛的认可，但如何采集合适的样本数量、如何从检测结果分析出需要的信息等，依然是困扰大多数从业者的问题。文章通过结合实际的临床检测案例，希望可以为该技术在规模化猪场的应用提供参考。

关键词：血清学检测；ELISA；样本数量；结果分析

血清学检测，是利用抗原抗体可以发生特异性反应而建立的一种体外检测方法。既可以利用已知的抗原（或病原）检测血清中对应的抗体，也可以利用已知的抗体来捕获血清中对应的抗原（或病原）。血清学检测技术包括凝集反应（如血凝和血凝抑制试验）、沉淀反应（如琼扩试验）、标记抗体技术（如酶联免疫吸附试验，ELISA）、补体反应（如补体结合试验）［1， 2］。其中以ELISA检测技术在规模化猪场应用的最为广泛，但在实际工作中，笔者也发现在样品采集数量、检测结果分析及不同ELISA检测产品的正确使用上，依然存在诸多问题。本文结合临床的一些检测案例，希望可以对以上问题做进一步的阐明，以供相关从业人员进行参考。

1 血清样品的采集

1.1 采集数量

一般来说，对于一个群体而言，样品采集的数量越多，越能代表或者反映整个动物群体的状况，但同时养殖者也需付出较高的经济成本。因此，采集合适数量的样品，既能达到血清学检测的目的，又能最大化地降低成本，是非常重要的。采样数量主要受检测的目的、样本群体大小、置信度和预估流行率（感染率）等因素的影响，如果检测目的是评估疫苗免疫后的抗体阳性率水平，那么在置信度为95%，允许误差在15%左右时，若预估抗体阳性率在50%以上时，样本数量最多为43份；如果检测目的是监控猪群中某一疫病的感染情况，那么在置信度为95%，预估流行率为10%～20%时，则至少需要采集15份样品来进行评估［3-4］。根据临床检测的经验，结合流行病学的相关要求，我们总结了常规的猪群血清学抗体水平评估采样量（表1）和疫病感染情况的监测评估采样量（表2）。当然，在实际生产中也可由兽医人员根据该场的具体情况来拟定采样数量。

表1 规模化养猪场猪群抗体常规评估采样信息参考表

1.2 样品的保存

1.2.1 血清样品

采血后，室温下倾斜30°左右放置约30 min，待有黄色液体析出后，立即冷链发送相关机构进行检测；如果不能当天发送，则室温放置2 h，然后放4～8℃冰箱保存，保存时间不得超过5 d。超过5 d，则需要丢弃样品。对于-20 ℃保存的样品，可以持续3个月，但要避免反复冻融。

表2 规模化养猪场猪群疫情监测采样头份参考表

1.2.2 全血样品

如做抗凝血处理，4～8℃可以保存7 d；如果未做抗凝血处理，建议采血后立即发送检测单位。

1.3 检测频率

建议每年春秋进行两次系统的猪群抗体评估；其他可根据本场猪群的健康状况进行灵活的检测。

2 结果的判定

ELISA检测结果的展示，因检测方法的不同，呈现的形式也不同。以爱得士（IDEXX）的相关产品为例，通常有阻断率（如猪瘟抗体检测试剂盒）、S/P值（如猪蓝耳病抗体检测试剂盒）、S/N值（如伪狂犬病抗体检测试剂盒）。这些数值的大小在一定程度上也反映了血清中抗体或抗原（病原）水平的高低。对结果的进一步分析，主要有阳性率和变异系数（CV），其中变异系数也称为离散度，由样本检测结果的标准偏差除以检测结果的平均值而获得，主要反映了各个检测样本之间检测结果的一致性和均衡性，进而反映整个动物群体内抗体水平的均衡性，变异系数越小，说明动物群体内个体之间的抗体水平越接近，反之则预示着个体之间差异较大［5］。如在猪瘟抗体阻断率的分析中，如果变异系数低于40%，则认为猪群内个体间抗体水平较为一致，整个猪群处于基本相似的免疫状态，如果变异系数高于60%，则预示猪群内抗体水平极不均衡，需要采取干预措施。对于阴性和阳性结果的判定应根据使用产品的说明书来进行，阳性率等于阳性样本数除以被检测的样本总数。

3 ELISA检测技术在规模化猪场的应用

3.1 评估疫苗免疫效果

根据血清学的检测结果，通过对比免疫前和免疫后的检测结果，可以评估某种疫苗的免疫效果。一般来说，针对灭活疫苗，通常在第二次免疫后的2～4周进行评估（如口蹄疫、圆环病毒病疫苗）；对于弱毒活疫苗，通常在免疫后的4～6周进行评估（如猪瘟、伪狂犬病疫苗）。以某规模化猪场口蹄疫血清学检测结果为例（图1），母猪群在经过2次基础免疫后，OD值检测在1.2以上，且阳性率达到了100%，免疫效果良好，研究显示畜群的群体免疫力达到85%～90%便可以阻断一次口蹄疫的流行。商品猪检测显示，1次免疫后的效果并不好，10周龄前抗体水平、阳性率持续下降，在10周龄经过第2次免疫后，阳性率逐步升高，至14周龄时，阳性率达到83%，基本符合口蹄疫疫苗免疫后的抗体转换规律。

3.2 确定合理的免疫程序

对于弱毒疫苗的免疫，如猪瘟疫苗和伪狂犬病疫苗。选择合适的首免日龄是必要的，如果免疫过早，仔猪从母体获得的母源抗体会干扰首次疫苗免疫产生的效果；如果免疫过晚，则会增加猪群的免疫空白期，增加了猪群感染的风险。目前针对首免日龄的确定还没有一个统一的衡量标准。以笔者的经验看，建议猪瘟在整体阳性率低于60%，或者平均阻断率低于50%时（以爱德士的猪瘟抗体检测试剂盒为参考）进行首次免疫是比较合适的。伪狂犬病的母源抗体通常可以持续到8～10周龄，因此常在这一阶段进行免疫，同时也要参考本场商品猪伪狂犬病的感染压力，必要时在6～8周龄进行首次免疫，间隔4周以上进行第2次的免疫。通过血清学的检测，可以确定适合本场的首免日龄。

3.3 评估猪群的整体健康水平和对疫病的群体抵抗力

图1 某规模化猪场口蹄疫（FMDV）血清学检测结果（武汉科前口蹄疫抗体检测试剂盒）

图2 某规模化猪场猪蓝耳病抗体血清学检测结果（爱德士猪蓝耳病抗体检测试剂盒）

通过血清学的检测，结合猪群的临床表现，在一定程度上可以帮助我们了解猪群的整体健康状况和猪群对于某种疫病的抵抗能力。以某规模化猪场猪蓝耳病的抗体检测结果为例（图2）。本场母猪群免疫猪蓝耳病经典毒株VR2332，每年免疫3次，商品猪未免疫猪蓝耳病疫苗，且为两点式生产工艺，后备猪和母猪群S/P值在2.0左右，阳性率均大于90%，变异系数基本在40%左右，提示猪蓝耳病疫苗免疫效果较好，猪蓝耳病病毒在母猪群中处于一种较稳定的状态；商品猪8周龄之前，S/P值和阳性率在持续降低，8周龄后缓慢升高，至21周龄，S/P值达到1.5，阳性率为100%，说明商品猪经历了一个猪蓝耳病缓慢、温和感染的过程，现场查看，猪群并没有任何临床表现，因此总体来看，本场猪蓝耳病处于一种阳性稳定状态。

3.4 疫病的诊断监测

ELISA检测也可以用于疫病的诊断监测。一方面，通过大量的临床样本的血清学检测，可以评估某地区某种疫病的流行感染分布情况［6-7］；另一方面通过系统的血清抗体检测，可以清楚地推测出猪群在哪一个阶段感染了某种病原，进而采取合适的控制策略。以某规模猪场猪伪狂犬病毒gE抗体检测为例（图3），该场母猪群为伪狂犬病野毒阳性，阳性率达到80%以上，在对商品猪的持续检测中，我们发现猪群在9周龄以前，gE抗体阳性率持续下降，9周龄以后，阳性率上升明显，在13周龄达到了100%，提示猪群从9周龄开始，伪狂犬病野毒逐步侵入猪群，并迅速蔓延开来。因此我们在控制该病时，应该在5周龄到8周龄之间，用疫苗进行干预，间隔4周后进行强化免疫。

3.5 重要疫病的净化

血清学检测技术在疫病的净化过程中也发挥着重要的作用。在疫病的净化工作中，一般分为强化免疫、免疫无疫、不免无疫3个阶段，在这一过程中，如何区分疫苗免疫和野毒感染是一个关键的环节。美国、加拿大和欧洲一些国家，已成功完成了猪瘟、猪伪狂犬病、口蹄疫的净化工作，针对这3种疫病的血清学检测产品，可以很好地为我们开展疫病检测净化工作提供支撑。目前主要的产品有基于检测猪瘟Erns蛋白的抗原检测试剂盒、基于检测伪狂犬gE蛋白抗体的检测试剂盒、基于检测口蹄疫非结构蛋白3ABC抗体的检测试剂盒。这些产品可以有效地区分疫苗免疫和野毒感染状态，也正逐渐在实际生产中得到较为广泛的应用。

图3 某规模化猪场猪伪狂犬gE抗体血清学检测结果（爱德士检测试剂盒）

4 小结

ELISA检测技术具有操作简便，耗用时间相对较短，所需设备较少，检测结果受外界条件干扰较小，便于开展大量样本的检测等优点，在动物疫病防控领域发挥着重要的作用，也逐步成为养殖企业生产管理的组成部分。除了ELISA技术外，其他血清学检测技术，如血凝和血凝抑制、琼扩试验、玻片凝集试验、胶体金免疫层析等检测技术在养殖领域也有较广泛的应用，特别是基于胶体金免疫层析技术开发的快速检测试纸条，操作更为简便、快捷，通常在10～15 min可以获得结果，具有很好的应用前景。在实际生产中，应充分考虑检测的目的，制订合理的采样方案和检测方案，对检测结果进行正确的分析，同时结合猪群的临床表现，才能获得有价值的信息，为生产实践提供参考。

参考文献

［1］ 孙黎，邓斌礼，吕辉. 血清学检测技术在畜禽生产中的应用［J］. 农民致富之友. 2014（12）： 258.

［2］ 姜杰，宋雯娟，谭茹.猪血清学检测的意义及注意事项［J］.今日养猪业. 2013（4）：43-44.

［3］ 卢受昇，丁红星. 当前主要动物疫病监测抽样数量的探讨［J］. 广东畜牧兽医科技. 2014，39（3）： 31-35.

［4］ 侯广宇，李金平，尚延明. 动物疫病流行病学调查样本量的确定［J］. 中国家禽. 2010， 32（7）： 45-46， 48.

［5］ 杨运清，张宏.变异系数差异的显著性检验［J］.东北农业大学学报.1994，25（1）： 27-31.

［6］ 马慧玲，郑霞，陈静，等. 山东省规模化猪场伪狂犬病感染流行率调查［J］. 山东畜牧兽医. 2015， 36（11）： 55-57.

［7］ 张成图，陈永忠，韩乐，等. 西宁地区生猪规模养殖场猪蓝耳病的血清学调查［J］. 畜禽业. 2010（9）： 58-59.

基金项目：国家生猪产业技术体系项目（CARS-36）；河南省生猪产业技术体系创新团队项目（S2012-06）

作者简介：郭振华（1984-），男，执业兽医师，预防兽医学博士，主要从事规模化猪场疫病防控工作。

通讯作者：乔松林，Email：cdj565@gmail.com

收稿日期：（2016-03-07）