何保丽，夏厚军，角建林，王春艳，张海林（.昆明医科大学实验动物学部，昆明 650500；.中国科学院昆明动物研究所，昆明 6503）



人工诱导树鼩乳腺肿瘤的病理分析

何保丽1，夏厚军2，角建林1，王春艳2，张海林2
（1.昆明医科大学实验动物学部，昆明 650500；2.中国科学院昆明动物研究所，昆明 650223）

【摘要】目的 建立树鼩乳腺肿瘤模型。方法 用DMBA联合人工合成孕激素MPA的方法，挑选45只雌性树鼩，随机分为3组。（1）DMBA组：连续3次进行DMBA（20 mg/次）灌胃处理，每周1次；（2）DMBA + MPA组：每3周1次，连续3次DMBA灌胃处理之后，于树鼩背部左侧皮下第1次植入MPA缓释片剂（150 mg/片，90 d缓释），间隔3个月，第2次植入MPA片；（3）正常对照组：使用花生油进行灌胃处理，每3周1次，连续3次。实验处理后，每周定期观察肿瘤发生情况，共观察45周。采用HE染色对诱发肿瘤的病理类型进行鉴定。结果 DMBA能单独诱导树鼩特异的产生乳腺肿瘤，诱发率为12%；联合MPA皮下植入可以把DMBA诱导的乳腺肿瘤发病率提高到50%；而对照组没有观察到乳腺肿瘤的发生。诱导的肿瘤主要为导管内乳头状瘤，恶性程度低，仅有一例为恶性程度高的浸润性导管癌。结论 所诱导的树鼩导管内乳头状瘤和浸润性导管癌均为人类共有的肿瘤病理类型。诱发肿瘤形态与自发肿瘤相似。

【关键词】树鼩；乳腺肿瘤；模型，动物

尽管早在1966年《Nature》就首次报道了一例树鼩自发性乳腺癌［1］，国内夏厚军等［2］报道了树鼩自发乳腺肿瘤的特征，但自那以后，极少见到学者成功建立树鼩的乳腺癌模型研究报道。

二甲基苯蒽（7，12-dimethylbenz（a）anthracene，DMBA）是目前诱发乳腺肿瘤常用的化学致癌剂，对乳腺的选择作用较强，特异性高达70%～80%［3］。它是一种多环芳烃类化合物，经代谢产生致癌物，从而引起DNA损伤，基因突变，最终导致肿瘤生成。DMBA所诱发的SD大鼠乳腺癌大多为ER + / PR +［4］，表明雌激素和孕激素可以加速DMBA诱发的乳腺癌生长。研究证实醋酸甲羟孕酮（medroxyprogesterone acetate，MPA），一种人工合成的孕酮衍生物，能够加速大鼠［5］或小鼠［6］DMBA诱发乳腺癌的速度。

DMBA和MPA是否也能在树鼩中诱发乳腺肿瘤仍然是未知的，鉴于此，我们的实验首次尝试用DMBA和MPA诱导树鼩的乳腺肿瘤，分析不同诱导组的差异，以了解化学致癌剂对树鼩致乳腺肿瘤的情况，进一步探讨DMBA诱导的树鼩乳腺肿瘤模型是否适于人类乳腺肿瘤的研究，以期为人类乳腺肿瘤的研究提供新的动物模型。

1　材料和方法

1.1动物及疼痛管理

实验用树鼩45只，雌性，3～4月龄，由昆明医科大学实验动物学部提供【SCXK（滇）K2013－ 0002】，均为人工繁殖的子一代树鼩。所有树鼩饲养在普通级动物饲养室，饲喂树鼩专用的全价饲料，自由饮水。实验观察期限为12个月。动物实验在昆明医科大学动物实验室进行【SYXK（滇）2015 －0002】。树鼩产生乳腺癌后，每天灌胃盐酸曲马多缓释片（2 mg/ kg），以防止和缓解癌痛。

1.2试剂

致癌剂DMBA购自美国Sigma公司，用花生油做为溶剂，DMBA终浓度为20 mg/ mL。MPA购自美国Innovative Research of America，IRA）公司，规格为150 mg/片，90 d缓释片剂。

1.3DMBA诱导的树鼩乳腺肿瘤模型的建立

1.3.1致癌剂灌胃和孕激素缓释片埋植

致癌剂DMBA和孕激素缓释片MPA联合诱导是建立乳腺癌动物模型的常用手段［4］。我们拟选取45只子一代性成熟的雌性树鼩（3～4个月），按体重随机分为3组，进行乳腺癌诱导实验。①DMBA + MPA组：每3周1次，连续3次DMBA灌胃处理之后，于树鼩背部左侧皮下植入MPA缓释片剂（150 mg/片，90 d缓释），间隔3个月植入第2次MPA片；②DMBA组：连续3次进行DMBA（20 mg/次）灌胃处理，每周1次；③正常对照组：使用花生油进行灌胃处理。12个月内观察树鼩乳腺癌发生情况。

1.3.2树鼩乳腺肿瘤发生过程中的观察、记录及标本采集

在进行DMBA灌胃操作以后，每周观察树鼩乳腺部位肿瘤生长情况。当有可触肿瘤出现时，记录肿瘤的发现时间（潜伏期）、肿瘤大小和转移情况。每周测量肿瘤的长径和宽径，依照公式V =πLW2/6计算肿瘤的体积，制作肿瘤生长曲线图。在致瘤过程中，记录树鼩死亡情况，制作生存曲线图。

树鼩乳腺标本的采集：灌胃DMBA后每周定期观察各组树鼩生长情况，观察各组树鼩肿瘤潜伏期（实验开始至肿瘤出现），肿瘤大小等，观察乳腺外观，发育情况，当肿瘤直径达到2 cm左右时将树鼩处死并解剖，将肿物完整切除，分别置于10%中性福尔马林溶液中固定、石蜡包埋、切片。其中当肿瘤出现破溃时则终止实验，并处死树鼩解剖，按实验结束统计。

1.3.3树鼩乳腺肿瘤病理形态学分析

在诱导树鼩乳腺癌模型中，当肿瘤最长径达到2 cm左右，手术活取肿瘤组织，通过HE组织染色后鉴定树鼩乳腺肿瘤所属类型。HE染色如下：切取肿瘤组织标本经甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，组织包埋，连续切片厚约5 μm，二甲苯脱蜡，无水酒精及各级酒精梯度水化，苏木素染色，1%盐酸酒精分色，返蓝，0. 5%伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光学显微镜10倍（低倍）物镜及40倍（高倍）物镜下观察，记录肿瘤的病理形态及恶性程度。

2　结果

2.1DMBA诱发乳腺肿瘤发生

由于树鼩是胆小易受惊的动物，应激性很强，有的树鼩在实验过程中因实验进行实验处理而死亡，尤其是在埋植MPA药片的时候。在实验结束时，DMBA + MPA组有6只树鼩存活，DMBA组有8只树鼩存活，对照组有9只树鼩存活。

DMBA组有1只树鼩发生了肿瘤，树鼩肿瘤发生率为12. 5%；DMBA + MPA组发生肿瘤的树鼩为3只，树鼩肿瘤发生比率为50%；在对照组没有观察到肿瘤发生，肿瘤图片见图1。与对照组相比，DMBA处理组的肿瘤发生率并没有增加（P = 0. 247，＞0. 05），而DMBA + MPA组的肿瘤发生率显著提高（P = 0. 018，＜0. 05）；DMBA + MPA组的肿瘤发生率与DMBA组相比没有显著差异（P = 0. 124，＞0. 05）。肿瘤发生的潜伏期为26～28周，第1只肿瘤发生在DMBA灌胃后第25周。

图1　DMBA诱导的树鼩乳腺肿瘤Note：A：Breast tumor in vivo；B：Tumor tissue in vitro.Fig. 1 DMBA-induced mammary tumors in tree shrews

2.2诱发乳腺肿瘤的病理类型

将这4个树鼩乳腺肿瘤进行HE染色后判断其所属类型（表1），共鉴定了2种类型，即乳头状瘤和浸润性导管癌，除#7外，其它树鼩肿瘤均为导管内乳头状瘤，属于良性肿瘤。#7为浸润性导管癌2级，属于恶性肿瘤。对照组#3仅为小叶增生。图2为各病理类型的代表性图片。导管内乳头状瘤显微镜下导管内可见乳头状结构，乳头中轴见纤维及血管，瘤细胞排列极性规则，细胞无异型性。DMBA诱导的两类乳腺肿瘤的形态结构与自发的相似。

图2为各病理类型的代表性图片。导管内乳头状瘤（#12）显微镜下结构与自发性导管内乳头状瘤极其一致，乳头表面及腔面被覆双层上皮细胞，内层为柱状上皮细胞，胞浆较丰富，外层为肌上皮细胞，其外包裹完整的基底膜。乳头中轴见纤维及血管，瘤细胞排列极性规则，细胞无异型性。#7的浸润性导管癌也与自发导管癌在结构上比较一致，癌细胞充满多个扩张的导管内腔隙，呈实性结构。癌细胞较大，形态多样，异型性明显，胞浆较丰富，核仁大，核膜厚，核分裂象多见。依据腺管形成的程度、细胞核多形性及核分裂数的多少将此浸润性导管癌分为中度分化的II级。

图2　DMBA诱发的肿瘤病理类型Note：A：normal tissue；B：intraductal papillomas；C：invasive duct carcinoma.Fig. 2 Pathological types of DMBA-induced mammary tumors in tree shrews

表1　DMBA诱导树鼩乳腺肿瘤的病理类型Tab. 1 Pathological types of DMBA-induced mammary tumors in tree shrews

3　讨论

至今为止，关于野生或人工驯养的树鼩人工诱导的肿瘤模型只有两个成功建立，一个是黄曲霉素B1［7］和HBV［8－9］联合诱导的肝癌模型，另一个是2-羟基丙基亚硝胺（2，2’-dihydroxy-di-npropylnitrosamine，DHPN）诱导的肺腺瘤模型［10］。由于缺乏转移的和免疫缺陷的树鼩，我们不得不采用诱导时间很长的化学诱导法，DMBA［11］和亚硝基甲基脲（N-methyl-nitrosourea，NMU）［12］是在啮齿类动物乳腺癌诱导中常用的两种致癌剂。实验中所使用的致癌剂DMBA主要是通过微粒体的羟化酶系经过羟基化和环氧化等代谢过程产生最终致癌物［13］。我们的研究选用了DMBA作为致癌剂，DMBA由于不溶于水而必须用油或吐温溶解。DMBA的给药方式可以通过灌胃［14］，也可以肌肉注射［15］，或者乳腺导管内注射［16］。我们采用灌胃的方式来进行给药。另外，越来越多的证据证明，在人类女性的雌激素联合孕酮的治疗中，长期的孕酮治疗增加乳腺癌的患病风险［17］。有研究发现孕酮和它的衍生物MPA足以诱导乳腺癌［18］，而且，MPA的致癌效应也被随后在大鼠、猫、狗和小鼠的研究所支持［19］，这些研究证实了MPA能加速乳腺癌的发生。本研究中，最早出现可触及的乳腺肿瘤的时间为实验处理后第25周，这一肿瘤潜伏期与大鼠的11周相差甚远，肿瘤诱发率也远低于大鼠（80%以上），与国内文献报道的注射法致癌不一致［20－21］。出现这一情况的原因除了DMBA的给药方法不同以外，可能还跟动物种属差异也有较大的关系，由于种属不同，对致癌剂的敏感性也不一样。我们的研究中还发现MPA能够加速DMBA诱导的树鼩乳腺肿瘤的发生，并提高肿瘤发病率。DMBA联合MPA诱导的树鼩乳腺肿瘤有两种类型，即导管内乳头状瘤和浸润性导管癌，其中，以导管内乳头状瘤为主，所诱导的乳腺肿瘤在组织形态、结构方面与自发乳腺肿瘤相似。DMBA诱导啮齿类会产生多种类型器官的肿瘤，而在树鼩，DMBA诱导树鼩产生的肿瘤集中在乳腺肿瘤，但大多是导管内乳头状瘤。虽说诱发树鼩肿瘤和自发的类型有相似之处，但与人高比例导管癌的情况有一定差异。

综上所述，采用DMBA灌胃的方法成功建立了树鼩的乳腺肿瘤模型，MPA与DMBA联合使用可以促进树鼩乳腺肿瘤的发生。所诱导的导管内乳头状瘤和浸润性导管癌均为人类共有的肿瘤类型，但存在潜伏期长、肿瘤发生率低、主要病理类型为非浸润性导管癌的缺点。这一方法所建立的肿瘤模型其肿瘤是非常不规则的形状，很难定期监测肿瘤准确生长速度和体积，在以后的研究中，课题组将着力解决这一问题。该模型的成功建立，为研究人类乳腺肿瘤的发生、发展、预防及治疗提供了一个新的比啮齿类动物更高级的动物模型。

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〔修回日期〕2015－12－25

Pathological analysis of the induced breast tumor models in tree shrew

HE Bao-li1，XIAO Hou-jun2，JIAO Jian-lin1，WANG Chun-yan2，ZHANG Hai-lin2
（1. Department of Laboratory Animal Science，Kunming Medical University，Kunming 650500，China；2. Kunming Institute of Zoology，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650223，China）

【Abstract】Objective To establish a tree shrew mode of breast tumor. Method Forty-five 3 to 4 month-old female tree shrews were orally gavaged with 20 mg 7，12-dimethylbenz（a）anthracene（DMBA）or peanut oil per animal for three times. Following that，fifteen DMBA administrated tree shrews were implanted 90 day-release medroxyprogesterone acetate（MPA）pellets. The tree shrews were palpated once weekly to detect mammary tumors for 45 weeks after first DMBA administration. Results DMBA were able to induce breast tumors（12. 5%）in tree shrews，and MPA increased the tumor incidence（50%）while no breast tumors were observed in the control group. Three induced breast tumors were intraductal papillary carcinomas and one was IDC by H&E stain. Conclusion All induced tumors are similar with spontaneous tumors in structure and molecular markers.

【Key words】Tree shrew；Mammary tumor；Mmodel，animal

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856（2016）03-0006-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 002

［基金项目］国家自然科学基金项目（31560613）；云南省应用基础研究昆医联合专项（2013FB126）；云南省应用基础研究计划（2013FZ071）。

［作者简介］何保丽（1978－），女，博士，从事人类疾病动物模型研究，Email：hbl117@ sina. com。