周清平，蒋孝华，符小波（.南华大学附一医院感染科，湖南衡阳 400；.湖南耒阳市人民医院神经内科，湖南耒阳 4800）



Nrf2抗氧化通路在CCl4所致大鼠急性肝损伤中的保护作用

周清平1，蒋孝华1，符小波2
（1.南华大学附一医院感染科，湖南衡阳 421001；2.湖南耒阳市人民医院神经内科，湖南耒阳 421800）

【摘要】目的 研究Nrf2氧化损伤通路在CCl4所致大鼠急性肝损伤中的保护作用。方法 将20只雄性Wistar大鼠随机分为溶剂对照组和CCl4组，每组10只，另选10只雄性Wistar大鼠，通过载体进行转基因大鼠雄原核显微注射，获得了目的基因Nrf2-tk整合与特异表达的转基因大鼠，作为CCl4+ Nrf2整合组。溶剂对照组静脉给予1%聚山梨酯－80，共4 d，CCl4组和Nrf2-tk整合组静脉给予1%聚山梨酯－80，共4 d，第4天给予1%聚山梨酯－80 30 min后，静脉给予7. 5 mg/ kg CCl4，24 h后处死大鼠。测定血清中AST、ALT和LDH的水平，分别测定肝脏组织中MDA、GSH、GSSG的含量，并计算GSH/ GSSG比值。留取肝脏组织，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织的病理变化。结果 和溶剂对照组相比，CCl4组大鼠的血清AST，ALT和LDH的水平明显升高（P＜0. 05），Nrf2-tk转基因组大鼠的AST，ALT和LDH的水平亦有轻度升高，但差异无统计学意义（P＞0. 05）。肝脏的MDA含量以及GSH/ GSSG比值显示Nrf2-tk整合组可以有效降低CCl4造成的脂质过氧化损伤和谷胱甘肽的消耗，肝脏病理观察结果显示和CCl4组相比，Nrf2-tk整合组明显减轻了CCl4造成的损伤。结论 Nrf2抗氧化损伤通路在CCl4所致大鼠急性肝损伤中的起着重要的保护作用。

【关键词】Nrf2；转基因大鼠；四氯化碳；急性肝损伤

核转录因子Nrf2（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是机体对抗氧化应激的主要调控因子［1］。其通过与抗氧化反应元件（an-tioxidant response element，ARE）结合调控下游抗氧化酶和II相解毒酶基因的转录活性，增强细胞清除活性氧自由基的能力，从而降低氧化应激对细胞、组织及器官造成损伤［2］。目前，Nrf2抗氧化损伤通路在急性肝损伤中的保护作用的研究还较少，我们拟通过以四氯化碳（CCl4）损伤大鼠为研究对象，通过血液的生化检查，肝脏组织的病理形态学分析来研究Nrf2抗氧化损伤通路在急性肝损伤中的保护作用。现报道如下。

1　材料和方法

1.1试剂和仪器

山羊抗人Nrf2多克隆抗体，大鼠抗人Nrf2单克隆抗体，大鼠抗人βactin单克隆抗体购自美国Sigma公司，Lipofectamine 2000脂质体，MTT粉末，免疫组化SP试剂盒，DAB显色试剂盒均购自北京中杉生物技术公司。PLLtk真核表达载体、RPMI Medium 1640培养基、pSV2neo筛选质粒购于美国Invitrogen公司、PTC200 PCR扩增仪，Westernblot转印仪，蛋白电泳仪购自美国BioRad公司。另备酶标仪，漩涡振荡器，24孔板，OMEM培养液，DMSO，移液枪等。

1.2大鼠Palb/ Ealb驱动Nrf2载体表达

本研究选择大鼠血清白蛋白基因启动子（ALB gene promoter，Palb）与位于Palb上游的增强子（ALB gene enhancer，Ealb）作为调控元件驱动目的基因Nrf2的表达。引进了通过PCR获得的含Kozak序列的Nrf2与不含该序列的Nrf2构建载体pLLtk与pLLtk cut，转染细胞HepG2与HC11，进一步提高了表达。

1.3划痕实验检测转染细胞迁移

用marker笔在6孔板背后均匀划横线，大约每隔0. 5～1 cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过2条线。在空中加入约5×105个细胞，24 h后用移液枪头垂直于背后的横线划痕，用PBS洗细胞洗3次，去除划下的细胞，加入有Nrf2基因的无血清培养基，放入37℃5%CO培养箱，培养，拍照。使用透射电镜观察、照相。

1.4Nrf2-tk转基因大鼠的产生

选取7～8周的Wistar大鼠，雄性，共20只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012－0001】。选择重组载体pLLtk，经过两步纯化，并通过雄原核显微注射技术作用于大鼠，获得了目的基因Nrf2-tk整合与特异表达的转基因大鼠，PCR，Western-blot，定量PCR检测转基因的整合。用Nrf2-tk抗兔多克隆抗体对转基因大鼠肝脏切片进行免疫组织化学分析［3］。

1.5动物分组及给药方案

另选将20只7～8周的Wistar大鼠，，购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK（京）2012 －0019】。雄性，将其随机分为溶剂对照组和CCl4组，每组10只。将造模成功的Nrf2-tk转基因大鼠，作为Nrf2-tk整合组。溶剂对照组静脉给予1%聚山梨酯－80，共4 d，CCl4组和Nrf2-tk整合组静脉给予1%聚山梨酯－80，4 d，第4天给予1%聚山梨酯－80 30 min后，静脉给予7. 5 mg/ kg CCl4。

1.6检测指标

经静脉给予CCl424 h后，将3组大鼠内眦静脉取血，制备血清，测定血清化学指标AST、ALT和LDH的水平，血清化学指标通过HITACHI 7020型自动生化分析仪测定。内眦静脉取血后处死大鼠，取出肝脏称重，分别切取50 mg组织制作组织匀浆，使用TBA法测定肝脏组织中MDA含量；另取50 mg组织制作组织匀浆，使用改良Hisson法测定肝脏组织中GSH、GSSG，计算GSH/ GSSG比值。留取肝脏左叶，常规石蜡包埋切片，HE染色，光学显微镜下观察肝脏组织的病理变化。

1.7统计分析

2　结果

2.120只大鼠通过雄原核显微注射技术成功建立7只原代转基因大鼠模型，整合率为35%（7/20）。定量PCR对转基因的拷贝数进行精确定量，可知7只建模成功的转基因大鼠其后代均为多拷贝重复，且拷贝数在各家系不相同，但同一家系转基因的拷贝数是相同的。

2.2Western-blotting分析

Nrf2-tk转基因大鼠的整合与多拷贝重复基因的连接方式，结果表明：7只转基因大鼠外源基因整合方式以多拷贝头尾串联连接为主。Real-time PCR分析转基因大鼠Nrf2-tk的转录，除肝脏与睾丸外其他组织与器官均没检测到Nrf2-tk的转录，说明Nrf2-tk的表达具有良好的组织特异性。用Nrf2-tk抗兔多克隆抗体对tk5F1tk455大鼠肝脏切片进行棉衣组织化学分析，发现Nrf2-tk在部分肝实质细胞内表达，表达细胞占总肝细胞的55%～75%（图1）。

图1　Real-time PCR分析Nrf2-tk mRNA的表达Note：M：100bp ladder，1：blank control，2：Hep-G2 cells（without transfection）and 3：Hep-G2 transfection of pCMV-tk. 4：Hep-G2 transfection of pLL-tk，5. Hep-G2 transfection of pLL-tk cut，6. HC-11 cells（without transfection）7. HC-11 transfection of pCMV-tk. 8. HC-11 transfection of pLL-tk，9. HC-11 transfection of pLL-tk.Fig. 1 Analysis of the expression of mRNA Nrf2-tk by Real-time PCR

2.3Real-time PCR结果显示

阳性对照质粒pCMV-tk，PLLtk与PLLtk cut转染Hep-G2细胞有390 bp的Nrf2-tk DNA特异性扩增条带，而阴性对照未转染Hep-G2细胞和空白对照没有特异性扩增条带。HC-11细胞经转染后，仅阳性质粒pCMV-tk转染细胞出现390 bp的Nrf2-tk DNA特异性扩增条带。495 bp的对照组GAPDH条带在所有细胞样本均出现，空白对照无。表明质粒pLLtk与pLLtk cut具有Nrf2-tk mRNA组织特异性转录活性。

2.43组大鼠血清生化指标结果

CCl4组大鼠经静脉给予CCl47. 5 mg/ kg后，血清中AST，ALT，LDH水平升高，与溶剂对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0. 01）。与CCl4组比较，Nrf2-tk转基因组AST，ALT，LDH水平明显下降（P ＜0. 01）（表1）。

表1　3组大鼠血清生化指标结果（±s）Tab. 1 Biochemical indexes of serum in 3 groups（±s）

表1　3组大鼠血清生化指标结果（±s）Tab. 1 Biochemical indexes of serum in 3 groups（±s）

注：与溶剂对照组比较，a：P＜0. 01；与CCl4组比较，b：P＜0. 01。Note：Compared with the solvent control group，a：P＜0. 01；compared with the CCl4 group，b：P＜0. 01.

组别　n　AST/ IU/ L　ALT/ IU/ L　LDH/ IU/ L溶剂对照组　10　102±19　38±5. 4　251±53 CCl4组　10　1163±393 a　1748±402 a　3273±1082 a CCl4 + Nrf2整合组　7　204±104 b　158±104 b　1293±301 b

2.53组大鼠肝脏MDA和GSH/ GSSG的比值

与溶剂对照组比较，CCl4组肝脏组织中的MDA水平明显升高，GSH/ GSSG比值明显下降，差异具有统计学意义（P＜0. 05）。与CCl4组比较，CCl4+ Nrf2转染组肝脏组织MDA水平明显下降，肝脏组织GSH/ GSSG比值明显升高，差异均有统计学意义（P＜0. 05）（表2）。

表2　3组大鼠肝脏MDA和GSH/ GSSG的比值Tab. 2 The ratio of MDA and GSH/ GSSG in liver of 3 groups

2.63组大鼠肝脏大体检查

肉眼观察可见溶剂对照组大鼠肝脏湿润有光泽，呈红褐色。CCl4组大鼠肝脏失去光泽，颜色灰暗。CCl4+ Nrf2转染组大鼠肝脏病变明显减轻，颜色趋于良好。

2.7组织学观察

溶剂对照组大鼠，肝小叶轮廓清晰，肝组织以中央静脉为中心呈条索状向四周放射状排列，肝细胞排列整齐，肝细胞未见变性、坏死及脂肪变性（图1A）。CCl4组可观察到肝组织损伤，肝细胞浊肿、气球样变性，以肝小叶中央静脉为中心的坏死，肝小叶内可见灶性坏死区，可见多量的凋亡细胞（图1B，D，图2A-C）。与CCl4组比较，CCl4+ Nrf2整合组肝脏细胞结构破坏程度较轻，变性坏死细胞较少，整体情况优于CCl4组（图1C）。

图2　3组大鼠肝组织病理切片（HE×40）Fig. 2 Pathological sections of rat liver tissue in 3 groups（HE×40）

图3　CCl4组大鼠肝组织病理切片：点状或病灶性坏死，炎性细胞浸润，有凋亡细胞存在，肝细胞增生。（HE×40）Fig. 3 Rat liver tissue pathology in CCl4group：Point or focal necrosis，inflammatory cell infiltration，cell apoptosis and proliferation liver cell proliferation.（HE×40）

3　讨论

肝脏疾病作为人类最常见的疾病之一，对人类健康和社会造成严峻威胁。肝脏损伤是各种肝脏疾病的病变结果，其防治是现代医学的重大课题［4］。因此通过建立肝损伤动物模型，研究肝病的发生发展的机制，探索肝损伤的治疗方向，具有重要的临床意义［5－6］。近年来，转基因动物技术在人类肝脏疾病模型建立中发挥了重要的作用。通过转基因技术，可以选择性的杀死动物体的某些特定类型的细胞，从而模仿某种疾病［7－8］。基于以上研究，本研究拟通过载体将基因Nrf2整合入大鼠模型，制作出特异表达的转基因大鼠，并进一步通过注射CCl4诱导Nrf2-tk转基因大鼠的肝脏损伤，进而明确Nrf2氧化损伤通路在CCl4所致大鼠急性肝损伤中的保护作用。

Nrf2/ ARE是近年新发现的机体抵抗内外氧化和化学等刺激的防御性转导通路［9－10］。氧化应激作用下，Nrf2可启动ARE调控的Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶的表达，如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、血红素氧合酶-1（HO-1）等，从而增加细胞对氧化应激的抗性，为肝脏疾病的发生发展起到积极的防护作用［9－10］。研究发现，在Nrf2敲除的大鼠中，正常情况和诱导情况下的Ⅱ相酶水平如GST、NQO1、γ-GCS显著减少。

在本研究中，我们通过雄原核显微注射技术成功建立了原代Nrf2转基因大鼠模型［11－12］，随后我们采用RT-PCR分析转基因大鼠Nrf2-tk的转录，除肝脏与睾丸外其他组织与器官均没检测到Nrf2-tk的转录，说明Nrf2-tk的表达具有良好的组织特异性。用Nrf2-tk抗兔多克隆抗体对tk5F1tk455大鼠肝脏切片进行棉衣组织化学分析，发现Nrf2-tk在部分肝实质细胞内表达，表达细胞占总肝细胞的55% ～75%，证明Nrf2转基因大鼠模型建立良好。

CCl4是经典的肝毒物，其病变主要引起中央静脉周围肝细胞坏死，纤维增生为窦缝隙为主［13－14］。本研究中，CCl4组大鼠给予CCl424 h后，其体重下降，肝体比、肾体比增加，血清中AST，ALT和LDH水平显著上升，肝脏组织病理学改变明显，表明CCl4对大鼠造成了急性的肝脏损伤。与CCl4组比较，CCl4+ Nrf2整合组AST，ALT和LDH水平较低，差异有统计学意义。在CCl4+ Nrf2整合组大鼠肝脏的病理学观察中，细胞结构明显优于CCl4组，细胞坏死减少，组织结构清晰。表明Nrf2转基因大鼠可以有效地减弱CCl4对肝脏造成的损伤。

MDA是组织中不饱和脂肪酸过氧化的最终产物，GSH/ GSSG比值反映了组织抵御氧化性损伤的水平，两者是常用的抗氧化指标［15－16］。在本研究中，给予CCl424 h后，大鼠肝脏组织中MDA水平明显升高，GSH/ GSSG比值明显降低都说明了CCl4对大鼠的肝脏产生了氧化性损伤。而CCl4 + Nrf2整合组大鼠肝脏组织中MDA水平与CCl4组比较，明显降低；GSH/ GSSG比值与CCl4组比较，明显升高。提示Nrf2可诱导体内GSH的合成，进而抑制CCl4对肝脏造成的损伤［17］。

经CCl4处理后，对3组大鼠肝脏组织进行病理形态学分析组织学观察，可见CCl4组可观察到肝组织损伤，肝细胞浊肿、气球样变性，以肝小叶中央静脉为中心的坏死，肝小叶内可见灶性坏死区，可见多量的凋亡细胞。与CCl4组比较，CCl4+ Nrf2整合组肝脏细胞结构破坏程度较轻，变性坏死细胞较少，整体情况优于CCl4组。以上结果表明Nrf2-tk转基因大鼠可有效减轻生理功能与形态学改变的肝脏损伤。

综上所述，根据本研究得到的结果，可以推测Nrf2/ ARE抗氧化通路可通过调动机体的抗氧化体系来抑制CCl4对大鼠的肝脏产生的损伤，但对于Nrf2/ ARE通路是否还存在其他的途径来发挥对肝脏的保护作用仍需要进一步探索。本研究成果为探讨肝病的发病机制提供了科学数据，为肝脏疾病诊断和治疗的研究奠定了基础［18－19］。

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〔修回日期〕2016－01－12

Effect of Nrf2 signal pathway on acute hepatotoxicity induced by CCl4in rat

ZHOU Qing-ping1，JIANG Xiao-hua1，FU Xiao-bo2
（1. Department of infectious diseases of the First Affiliated Hospital of University of South China，Hunan Hengyang 421001，China；2. Department of Internal Medicine of the People’s Hospital，Hunan Leiyang 421800，China）

【Abstract】Objective To determine the effect of Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2（Nrf2）on acute hephrotoxicity induced by CCl4 in male rat. Methods 20 male Wistar rats were randomly divided into control group and CCl4group，10 rats in each group，another 10 male Wistar rats were transgenic rats microinjection through the carrier，obtained the Nrf2-tk gene integration and specific transgenic rats，as the CCl4+ Nrf2 integration group. The groups was given 1%polysorbate 80 for 4 days，Then the CCl4and CCl4+ Nrf2 integration group were intraperitoneally injected with a single dose of CCl47. 5 mg·kg－1and were killed 24 h after CCl4injection. The serum chemical parameters including asparate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT）and lactate dehydrogenase（LDH）were measured. Also malonaldehyde（MDA），glutathione（GSH），oxidized glutathione（GSSG）levels in the liver as well as glutathione（GSH）/ oxidized glutathione（GSSG）ratios were detected. Histopathologic changes in the liver were examined. Results F1generation TK transgenic rats in liver and testis and other tissues and organs were not detected the transcription of Nrf2-tk，indicating that Nrf2-tk expression in tissues is specific good. Nrf2 significantly reduced serum AST，ALT and LDH levels in a dose-dependent manner. The results of MDA levels and GSH/ GSSG ratios in liver and kidney showed that Nrf2reduced CCl4-induced hepatic lipid peroxidation，and ameliorated glutathione depletion. The histopathologic results showed that Nrf2 restrained liver and kidney damage induced by CCl4. Conclusion Nrf2 can effectively protect male rat from acute hepatotoxicity and nephrotoxicity induced by CCl4.

【Key words】Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2（Nrf2）；Transgenic rat models；CCl4；Acute hepatotoxicity induced

【中图分类号】R-332

【文献标识码】A

【文章编号】1671-7856（2016）03-0052-06

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 011