李岩琦,张　敏,赵源征,郭亚培,刘恒方#

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多西霉素对局灶性脑缺血小鼠炎症反应的影响

李岩琦1),张敏2),赵源征2),郭亚培2),刘恒方2)#

1)郑州大学医院内科 郑州 4500012)郑州大学第五附属医院神经内科 郑州 450052

关键词多西霉素；脑缺血；炎症反应；小鼠

脑缺血后数小时内脑组织会发生炎症反应，炎症对神经元的损伤可延续数日至数周[1]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)是一类能够破坏细胞外基质结构的蛋白水解酶，许多神经系统疾病的病理生理过程中均伴随MMP活性增加[2]。因此，急性脑缺血后脑组织炎症损伤可能与MMP密切相关。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)属于趋化因子家族，能通过诱导炎症细胞聚集加重组织损伤[3]。MCP-1激活被认为是白细胞浸润的关键步骤[4]。肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)属于前炎症因子，其激活是神经系统炎症反应的关键环节，并且可能参与血脑屏障的破坏及脑组织内炎症反应的起始环节[5-6]。作者观察了MMP抑制剂多西霉素对光化学法诱导的局灶性脑缺血模型小鼠缺血皮层中MCP-1和TNF-α表达的影响，探讨其用于脑缺血治疗的机制。

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1材料与方法

1.1实验动物36只清洁级成年雄性小鼠由郑州大学实验动物中心提供，体重21～25 g。小鼠被饲养于22～25 ℃的房间内，12 h光照及黑暗交替，自由获取食物及水。

曾经有机构对财富五百强公司年度数据进行过研究分析得出，几个大股东的实质是投资者利用投票权积极影响公司的运营和管理。一旦公司做出投资决策，投资者对项目回报的不同的偏好，具体取决于部分投资者持有的股东权益。不同股东之间存在利益冲突，促使投资者购买更多股票从而确保公司的风险和利润接近其最佳目标。换句话来说，大股东持有更多股票的优势在于它们可以影响投资决策，并且更容易接近投资者的潜在偏好，多个大股东的出现实际上是一种利益大于成本的权衡。

1.2脑缺血模型的建立依照Shin等[7]的方法并做部分改进，建立光化学诱导的小鼠局灶性脑缺血模型。小鼠经水合氯醛腹腔注射麻醉(450 mg/kg)成功后，固定头部，保持肛温在(37.0±0.5) ℃。沿正中线切开头皮，暴露颅骨前囟点及人字点。先腹腔注射10 g/L玫瑰红荧光素0.1 mL，5 min后用冷光源发射直径4 mm的光束，照射前囟点旁开2 mm处15 min，冷光源尽量接近颅骨，以避免光束发散致周围组织损伤。然后缝合皮肤，令小鼠自然复苏。

1.4.1梗死体积测定参照文献[7]方法测定小鼠脑梗死体积。术后72 h，小鼠经乌拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉，断头处死，快速取出脑组织，于冷生理盐水中浸泡10 min。自脑前极后2 mm开始，共切5个冠状脑片，厚度约2 mm，在TTC溶液中37 ℃浸泡30 min后，经中性甲醛溶液固定。每个脑片进行数码照相，应用图像分析系统AxioVision LE(Carl Zeiss)计算梗死面积。梗死体积=梗死面积×脑片厚度。5张脑片的梗死体积相加，即为总的梗死体积。

2.13组梗死体积的比较假手术组未发生梗死。模型组和多西霉素组梗死体积分别为(66.218±9.163)和(44.36±5.518) mm3；与模型组相比，多西霉素组梗死体积明显减小(t=3.158,P=0.009)。

1.3实验分组36只小鼠被随机分为假手术组、模型组、多西霉素组，每组12只。模型组、多西霉素组小鼠按1.2方法造模，假手术组仅切开头皮，不进行冷光照射。所有小鼠对手术过程耐受良好。多西霉素组小鼠术后1 h给予多西霉素(美国Sigma公司)腹腔注射，剂量为2 mg/kg， 6、24和48 h后分别给予相同剂量皮下注射，以加强药效。假手术组和模型组小鼠给予等体积生理盐水。

算法1、算法2和算法3采用C++语言实现，在Linux下使用g++编译器编译；算法4则采用C语言实现，在Linux下使用gcc编译器编译.使用MCNC和ITC99基准电路在配置为Intel Core i7-6500U CPU 8GB RAM的个人计算机上对算法1进行验证，并与其他采用不同信号概率计算方法的MPRM电路功耗计算方法进行比较.

为应对“黄金周”期间游客集中出游所导致的运营管理难度的增加及成本的上升，其间的协调涉及到的利益相关者更多，包括其他旅游企业、金融业、知识产权部门等，较为复杂，企业协调机制的构建是必要的，企业协调机制内能解决的问题应快速处理，若企业协调机制运行规范高效，就会对旅游合作起到很大的促进作用，因为它担负着多数企业间利益协调任务，为应对“黄金周”期间以及其他各类冲击所带来的运营管理成本上升问题提供了解决路径。

2结果

1.4观察指标

1.5统计学处理采用SPSS 17.0进行统计分析。组间比较采用两独立样本t检验、单因素方差分析及LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2.23组脑皮层MCP-1和TNF-α表达的比较见图1和表1。可以看出，与假手术组比较，模型组小鼠脑皮层MCP-1和TNF-α表达均明显增强；与模型组相比，多西霉素组小鼠脑皮层MCP-1和TNF-α表达明显减弱。

1：假手术组；2：模型组；3：多西霉素组；A:MCP-1；B:TNF-α。图1　3组小鼠脑皮层MCP-1和TNF-α的表达(SP,图中比例尺相当于50 μm)

表1　3组小鼠脑皮层MCP-1和TNF-α表达的比较

*：与假手术组相比，P<0.001；#:与模型组相比，P<0.05。

3讨论

局灶性脑缺血介导小胶质细胞活化、星形胶质细胞增生和白细胞向缺血区域浸润。这些细胞能产生多种生长因子、细胞因子和趋化因子[8]。炎症反应在脑缺血中扮演重要角色[9]。一些炎症因子可加重急性脑缺血损伤。MMP能调节细胞外基质，降解基底膜。基底膜在维持血脑屏障稳定性中发挥重要作用，因此，脑缺血后继发MMP表达上调能够加速基底膜降解，导致血脑屏障破坏[10]。在许多中枢神经系统疾病所伴随的炎症损伤中都存在MMP表达的上调[2]。多西霉素属于四环素类抗生素，能抑制数种MMP的活性，包括MMP-9及MMP-2等[11]，在临床上作为非特异性MMP抑制剂使用。

趋化因子作为一种调节性多肽，参与免疫应答中细胞的相互作用和白细胞的聚集过程，在炎症反应中扮演重要角色。有研究[12]表明，MCP-1在脑缺血后12 h表达明显增高。MCP-1基因缺陷小鼠的脑梗死体积小于正常小鼠[13]。同样，MCP-1受体基因敲除小鼠脑缺血后具有较小的脑梗死体积、较轻的脑水肿程度，其炎症细胞浸润和炎症介质的表达也较少[14]。脑缺血后TNF-α的表达增高往往伴随神经功能缺失的加重和梗死体积的扩大，表明该细胞因子在脑缺血损伤中发挥关键作用[5-6]。该研究发现，多西霉素能显著减少光化学诱导的局灶性脑缺血小鼠脑梗死体积和皮层炎症介质MCP-1和TNF-α的表达，减少脑缺血造成的损伤。TNF-α通过降解鸟苷酸环化酶和蛋白酪氨酸激酶来破坏血脑屏障[15]。因此，作者推测多西霉素能通过抑制TNF-α的活性来起到保护血脑屏障的作用。

综上所述，多西霉素能减少光化学方法诱导的脑缺血损伤，减轻脑缺血后的炎症反应，有可能为临床治疗脑缺血提供新的思路。

参考文献

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(2015-03-10收稿责任编辑王曼)

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.035

#通信作者，男，1965年8月生，博士，主任医师，教授，研究方向：脑血管病，E-mail:hengfangliu@sohu.com