王维昊，林　森，王洪波，王红娟，许伟华

山东大学第二医院消化内科 济南 250033

Nrf2对肝纤维化过程中炎症细胞的影响

王维昊，林森，王洪波，王红娟，许伟华#

山东大学第二医院消化内科 济南 250033

关键词核因子相关因子2；中性粒细胞；巨噬细胞；肝纤维化；小鼠

摘要目的：探索在四氯化碳诱导小鼠肝纤维化形成过程中，核因子相关因子2(Nrf2)对炎症细胞浸润的影响。方法：野生鼠和Nrf2基因敲除鼠各24只，分别随机平均分成对照组和模型组。HE染色、Masson三色染色观察肝组织病理学变化及肝脏纤维化程度；天狼星红染色观察胶原沉积情况；免疫组化方法检测肝组织中中性粒细胞浸润(Ly6-G阳性)情况；免疫荧光方法检测巨噬细胞浸润及活化(ER-MP23阳性)情况。结果：两个对照组均未有肝纤维化表现；基因敲除模型组小鼠肝组织坏死及纤维化程度重于野生模型组，胶原含量更多(P<0.05)。四氯化碳诱导可增强肝组织中中性粒细胞的浸润，但基因敲除鼠中性粒细胞浸润轻于野生模型鼠(P<0.05)。Nrf2基因敲除和四氯化碳诱导均增强肝组织中巨噬细胞的活化，两者具有协同效应(P<0.05)。结论：Nrf2可以通过抑制巨噬细胞活化抑制四氯化碳诱导的肝纤维化发展。

肝纤维化是绝大部分慢性肝病发展到肝硬化的必经过程，其发生机制主要是肝脏损伤因素持续存在(如酒精、病毒、药物等)，引起肝细胞变性坏死、炎症细胞浸润，继而使肝内纤维结缔组织异常增生。各种原因导致的肝纤维化病程进展中都伴有不同程度的氧化应激，持续的氧化应激可以加重肝细胞损伤、促进炎症介质及细胞因子的释放、促进肝星状细胞的活化，加速肝纤维化的进程[1]。核因子相关因子2(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)是抗氧化应激的关键分子，当细胞受到氧化应激损伤时，Nrf2表达上调，促进抗氧化基因的表达，减少细胞损伤[2]。前期研究[3]显示，在四氯化碳诱导的急性肝损伤中，相比野生鼠，Nrf2基因敲除鼠肝组织中IL-1α、TNF-α、IFN-α等炎症介质分泌增多，中性粒细胞浸润增多且持续时间延长。在此基础上，作者观察了四氯化碳诱导的慢性肝纤维化形成过程中，Nrf2对中性粒细胞浸润和巨噬细胞激活的影响，报道如下。

1材料与方法

1.1动物小鼠均由瑞士ETH大学细胞生物学院提供，饲养于SPF条件下，体重(20±5) g，野生鼠和Nrf2基因敲除(Nrf2-/-)鼠各24只。

1.2药物和试剂四氯化碳购自国药集团化学试剂有限公司，用矿物油稀释至60%。Ly6-G抗体购于瑞士BD Pharmingen公司，ER-MP23购于Abcam公司，二抗购于美国Jackson ImmunoResearch实验室，ABC试剂盒购于加拿大Vector实验室。

1.3实验分组实验分4组：野生对照组、Nrf2-/-对照组、野生模型组、Nrf2-/-模型组，每组12只。模型组给予矿物油稀释的四氯化碳腹腔注射，每3 d注射1次，每次0.5 mL/kg，共注射15次，最后一次注射3 d后处死小鼠；对照组仅给予相同剂量的矿物油腹腔注射，其他操作同模型组。

1.4肝组织损伤程度及纤维化程度评价处死小鼠后，取小鼠肝脏，一部分置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，常规方法制备3.5 μm厚石蜡切片，分别进行HE染色、Masson三色染色和天狼星红染色，显微镜下观察并拍照。HE、Masson染色用于观察肝细胞坏死情况、炎症细胞浸润程度、纤维组织增生程度、小叶结构是否紊乱；天狼星红染色用于观察胶原沉积情况。每张切片选取5个不重复视野观察，Masson染色以蓝色信号为阳性，天狼星红染色以红色信号为阳性。用IPP软件进行定量分析，计算阳性信号面积与视野内肝组织总面积之比，取平均值。

1.5肝组织中中性粒细胞浸润和巨噬细胞激活的检测取另一部分肝脏置于体积分数95%的酸性乙醇中固定，常规方法制备3.5 μm厚石蜡切片，浸入用30 g/L牛血清白蛋白、pH为7.4的PBST稀释的Ly6-G抗体和ER-MP23抗体中4 ℃过夜，PBST摇洗3次，每次5 min，后滴加稀释好的二抗，细胞核用Hoechst复染，37 ℃恒温30 min后，用激光共聚焦荧光显微镜观察并拍照。用IPP软件定量分析：每张片子选取5个不重复视野，计数每个视野(×20)的阳性细胞数，取平均值。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0进行数据分析，两样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用方差分析。检验水准α=0.05。

2结果

2.1肝组织病理学变化HE染色结果见图1。野生对照组和Nrf2-/-对照组小鼠肝小叶结构清晰，肝组织正常，未见明显肝细胞变性坏死。野生模型组小鼠可见大量肝细胞脂肪变性，中央静脉及汇管区大量炎症细胞浸润，并出现深染的纤维结缔组织；Nrf2-/-模型组小鼠肝细胞变性坏死较野生模型组更加明显，肝板结构消失，弥漫性炎症细胞浸润，有明显纤维间隔形成。Masson三色染色结果(图2、表1)显示：对照组小鼠均不存在肝纤维化，Nrf2-/-模型组肝纤维化面积较野生模型组明显增大。天狼星红染色(图3、表1)结果显示；对照组小鼠均不存在肝组织胶原沉积，Nrf2-/-模型组肝组织中胶原沉积较野生模型组明显增多。

A:野生对照组；B:Nrf2-/-对照组；C:野生模型组；D:Nrf2-/-模型组。图1　4组肝组织HE染色结果(×20)

A:野生对照组；B:Nrf2-/-对照组；C:野生模型组；D:Nrf2-/-模型组。图2　4组肝组织Masson三色染色结果(×20)

A:野生对照组；B:Nrf2-/-对照组；C:野生模型组；D:Nrf2-/-模型组。图3　4组肝组织天狼星红染色结果(×20)

%

2.2中性粒细胞浸润和巨噬细胞激活情况见图4、图5和表2、表3。

A:野生对照组；B:Nrf2-/-对照组；C:野生模型组；D:Nrf2-/-模型组。图4　4组Ly6-G(中性粒细胞浸润)免疫组化染色结果(×20)

A:野生对照组；B:Nrf2-/-对照组；C:野生模型组；D:Nrf2-/-模型组。图5　4组ER-MP23(巨噬细胞激活)免疫荧光染色结果(×20)

表24组肝中性粒细胞浸润比较(n=12)阳性细胞/mm2

模型Nrf2-+-70.839±31.88363.275±24.257+69.407±26.125127.499±42.411

F模型=11.579，P=0.001；FNrf2=7.498，P=0.009；F交互=12.660，P=0.001。

表34组肝巨噬细胞激活比较(n=12)阳性细胞/mm2

模型Nrf2-+-59.118±27.49846.944±28.326+196.083±35.04096.150±25.731

F模型=120.473，FNrf2=43.804，F交互=26.755，P均<0.001。

3讨论

肝纤维化是肝脏受损后的一种积极的自我修复过程。无论是何种原因导致的肝纤维化，都伴随着慢性炎症的刺激，肝脏炎症反应和肝纤维化密切相关[4]。这种炎症反应主要表现为炎症介质的释放和炎症细胞的浸润[5]。肝纤维化不断进展的一个重要的影响因素就是氧化应激，氧化应激的积累可以引起蛋白质变性和DNA损伤，加重肝细胞的坏死和凋亡，还能促进炎症介质和细胞因子的释放，加重其介导的炎症反应。Nrf2作为体内的抗氧化反应的关键靶点，可保护组织细胞免受氧化应激的损伤，同时也具有一定的抗炎作用[6]。Nrf2可以通过上调抗氧化基因表达、抑制TGF-β等细胞因子释放、促进胶原降解等多途径抑制肝纤维化的快速进展[7]。该研究结果显示，与野生鼠比较，四氯化碳诱导的Nrf2-/-小鼠肝细胞坏死和胶原沉积程度更严重，表现出更严重的纤维化，证实Nrf2在肝纤维化进程中发挥了抑制作用。

在肝纤维化过程中伴随着中性粒细胞的浸润增多，而且中性粒细胞浸润在一定程度上对肝纤维化有促进作用[8-9]。但Saito等[10]的研究显示，在胆总管结扎导致的肝纤维化过程中，减少中性粒细胞或使其功能缺失并不能显著改善肝纤维化的程度，也就是说虽然中性粒细胞已被证实可以促进肝纤维化的进程，但是其在肝纤维化形成中的作用并非关键。该研究结果显示，经四氯化碳诱导，野生小鼠肝组织中中性粒细胞浸润增强(Ly6-G阳性细胞数量增加)；与野生鼠相比，Nrf2-/-鼠中性粒细胞浸润减少，但是肝纤维化程度却明显加重。之前研究[3]显示，在四氯化碳所致的急性肝损伤时，Nrf2敲除鼠中性粒细胞浸润较野生鼠更明显，说明急性肝损伤中Nrf2可以在一定程度上抑制中性粒细胞浸润。这种在急性肝损伤和慢性肝纤维化中，Nrf2对中性粒细胞浸润的两种截然不同的影响，其原因还有待进一步探索。毕竟，肝纤维化时中性粒细胞浸润是个复杂的细胞跨膜迁移过程，不仅需要炎症介质的吸引，还需要一些其他信号分子共同作用使中性粒细胞渗出[11]，即使在敲除Nrf2后炎症介质释放增加，也可能通过影响其他信号分子使中性粒细胞浸润减少，但具体机制还需进一步研究。总之，在四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化过程中，肝内中性粒细胞浸润在一定程度上需要依赖Nrf2的参与。

肝脏的巨噬细胞是库普弗细胞，在肝脏受到损伤时活化，主要通过释放细胞因子(如TGF-β、TNF-α等)刺激肝星状细胞分泌细胞外基质，促进肝纤维化进展[12]。在肝纤维化进展阶段，敲除巨噬细胞可以有效抑制肝纤维化进展[13]。然而，巨噬细胞也可以吞噬坏死的肝细胞和增生的胶原，在肝纤维化恢复阶段发挥积极的作用。有研究[14-15]显示，在肝纤维化恢复阶段，敲除巨噬细胞可以导致细胞外基质的持续积累，延缓肝脏的修复再生。这是由于在肝纤维化形成和修复阶段，巨噬细胞表型不同而发挥的作用不同所致。该研究结果显示，在肝纤维化形成过程中，Nrf2敲除鼠相比野生鼠肝内ER-MP23阳性细胞明显增多，Nrf2敲除促进了巨噬细胞的浸润，提示Nrf2可能通过抑制肝内巨噬细胞的活化而发挥抗纤维化的作用。

综上所述，Nrf2作为体内关键的抗氧化应激分子，可以抑制四氯化碳所致的肝纤维化进程，这种抑制作用可以通过抑制肝内巨噬细胞的活化而实现。在四氯化碳所致的肝纤维化中，Nrf2反而加重了中性粒细胞的浸润，这可能是Nrf2在对抗肝纤维化的积极作用中的一个不利因素，其具体机制还需进一步证实和研究。

致谢：感谢瑞士苏黎世 ETH生物学院Sabine Werner教授提供的实验条件，感谢Tobias A Beyer博士提供的实验指导。

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Effects of nuclear factor-E2 related factor 2 on inflammatory cells during liver fibrosis

WANGWeihao,LINSen,WANGHongbo,WANGHongjuan,XUWeihua

DepartmentofGastroenterology,theSecondHospital，ShandongUniversity,Jinan250033

Key wordsNrf2;neutrophil;macrophage;liver fibrosis;mouse

AbstractAim: To investigate the effects of nuclear factor-E2 related factor 2(Nrf2) on infiltration of inflammatory cells from rats with CCl4-induced liver fibrosis. Methods: There were four groups including wild type(WT) control group(WT mice without CCl4-induction), WT-CCl4 group(WT mice with CCl4-induction), Nrf2 knockout(Nrf2-/-) control group(Nrf2-/-mice without CCl4-induction) and Nrf2-/--CCl4 group(Nrf2-/-mice with CCl4-induction), and 12 in each group. Histological morphology was studied by HE staining,Masson triple staining, and Sirius red staining was used to observe the deposition of collagen.Neutrophils(labelled by Ly6-G ) and macrophages(labelled by ER-MP23) infiltration were detected by immunohistochemical staining and immunofluorescence,respectively. Results: The two control groups had no liver fibrosis pathogenic manifestations; the liver fibrosis was more severe and collagen content was higher in Nrf2-/--CCl4 group than those in WT-CCl4 group(P<0.05).In the WT-CCl4 group,the infiltration of neutrophils were increased obviously compared with control groups,but there was a significant decrease in the Nrf2-/--CCl4 group when compared with the WT-CCl4 group(P<0.05).The macrophages were infiltrated and activated in the model groups than in the control groups,especially in the Nrf2-/--CCl4 group(P<0.05).Conclusion: Nrf2 plays a protective role in CCl4-induced liver fibrosis via inhibiting the activation of macrophages.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.013

#通信作者，女，1967年4月生，博士，教授，主任医师，研究方向：慢性肝病、肝纤维化，E-mail：wwh60068@163.com

中图分类号R575.2