邢瑞星，赵玉兰，黄亚萍，董　静

郑州大学第二附属医院心内科 郑州 450014

螺内酯对心肌肥厚大鼠心肌组织中可溶性ST2表达的影响

邢瑞星，赵玉兰#，黄亚萍，董静

郑州大学第二附属医院心内科 郑州 450014

关键词螺内酯；心肌肥厚；可溶性ST2；大鼠

摘要目的：研究螺内酯对心肌肥厚大鼠IL-33/ST2通路中可溶性ST2(sST2)的影响。方法：选取健康雄性SD大鼠30只，随机分为对照组(n=10)、模型组(n=10)、药物干预组(n=10)。对照组皮下注射生理盐水，模型组皮下注射异丙肾上腺素(ISO)，药物干预组皮下注射ISO+螺内酯20 mg/(kg·d)灌胃，余各组用等量生理盐水灌胃。14 d后处死大鼠，测量心脏质量指数、左心室质量指数及心肌细胞直径；免疫组化法及RT-PCR法检测心肌组织中sST2的表达。结果：模型组与药物干预组心脏质量指数、左心室质量指数及心肌细胞直径均高于对照组(P<0.05)；模型组sST2的表达高于对照组和药物干预组(P<0.05)。结论：螺内酯可能通过调节IL-33/ST2通路中sST2的表达，抑制ISO诱导的心肌肥厚。

心肌肥厚是原发性高血压最常见的并发症,其病理变化包括心肌细胞自身的肥大以及间质的纤维化。心肌肥厚可降低冠状动脉内血流储备，造成心内膜下心肌缺血，诱发心律失常，同时与心力衰竭、猝死及脑卒中等密切相关。IL-33是IL-1家族新成员，为炎症性细胞因子。ST2是IL-1受体家族成员，ST2包括跨膜型ST2(transmembrane ST2,ST2L)及可溶性ST2(soluble ST2,sST2)，二者均可作为配体与IL-33结合。IL-33/ST2信号通路主要是一个受生物力学刺激的系统[1]。研究[2]表明醛固酮受体拮抗剂螺内酯可降低心力衰竭及心肌梗死中sST2水平，抑制心肌重构。该研究旨在探讨螺内酯是否通过降低sST2水平抑制心肌肥厚，为心功能不全早期干预提供治疗方法。

1材料与方法

1.1动物与试剂于河南省实验动物中心购买30只体重(body mass，BM)240～300 g的健康雄性SD大鼠，动物质量合格证号:SCXK(豫)2010-0002。上海禾丰制药有限公司生产的盐酸异丙肾上腺素(ISO)注射液2 mL/mg，批号131102。螺内酯片20 mg/片，浙江亚太药业股份有限公司提供。琼脂糖粉(上海生化试剂公司)，RNA抽提试剂盒Reagent(Transgene公司)，一抗为兔抗大鼠GATA4多克隆抗体，PCR引物、RT-PCR 试剂盒、DNA Marker由北京全式金生物技术有限公司提供。

1.2大鼠心肌肥厚模型制备及药物干预30只SD大鼠喂养1周后，按随机数字表法分为模型组、药物干预组、对照组(每组10只)。模型组与药物干预组皮下注射ISO 2.5 mg/(kg·d)；对照组皮下注射生理盐水，连续给药14 d。从造模当天起，将螺内酯片20 mg/(kg·d)溶于2 mL生理盐水中并对药物干预组大鼠灌胃，模型组及对照组用等体积生理盐水灌胃，共8周。

1.3大鼠心脏质量参数测定8周后称量3组大鼠BM。腹腔注射水合氯醛4 ml/kg麻醉，然后开胸取出心脏，剪去周围结缔组织及血管，预冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干后称全心质量(heart mass，HM)，再沿冠状沟剪去左心房，并沿室间沟剪掉右室游离壁，称左心室质量(left ventricular mass，LVM)，计算心脏质量指数(HM/BM)及左心室质量指数(LVM/BM)。最后将左心室均分为2份，1份放入40 g/L多聚甲醛中固定24 h后石蜡包埋切片，1份放入液氮中冷冻。

1.4大鼠心肌组织病理学观察取固定好的心肌组织，石蜡包埋，连续切片， HE染色，镜下观察。400倍镜下每张切片选10个视野，每个视野选10个细胞，用Image-plus图像分析软件测量心肌细胞直径，结果取均值。

1.5免疫组化法检测心肌组织中sST2的表达石蜡切片脱蜡至水，修复抗原，加sST2抗体，根据SP试剂盒说明书进行操作，DAB显色后用Lecia病理图像分析系统分析，并在400倍镜下选择5个视野测量光密度值，结果取均值。

1.6RT-PCR法检测心肌组织中sST2 mRNA的表达提取心肌组织总RNA。以GAPDH为内参，上游引物5’-GATCCCGCTAACATCAAAT-3’，下游引物5’-CAACCTGGTCCTCAGTGTAG-3’，扩增产物长度604 bp；sST2上游引物5’-ACGGAGAACGGAACCAAT-3’，下游引物5’-GCAAGCTGAGCAGGCAAT-3’，扩增产物长度156 bp。 PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃总延伸6 min。琼脂糖凝胶电泳，EB染色后于紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140图像记录系统进行分析， sST2 mRNA的相对表达量以sST2条带和GAPDH条带光密度比值表示。

1.7统计学处理采用SPSS 20.0进行统计学处理。3组间心肌肥厚参数、sST2蛋白及mRNA相对表达量的比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.13组大鼠HM/BM和LVM/BM比较见表1。

表1　3组大鼠心肌肥厚参数及心肌细胞直径比较

#:与对照组比较，P<0.05；*：与模型组比较，P<0.05。

2.23组大鼠心肌组织病理学变化及心肌细胞直径结果见图1、表1。

A：对照组;B：模型组;C：药物干预组。图1　3组大鼠心肌组织HE染色结果(×400)

2.33组大鼠心肌组织中sST2的表达结果见图2、3和表2。

A：对照组;B：模型组;C：药物干预组。图2　3组大鼠心肌组织中sST2蛋白的表达(SP,×400)

1：对照组；2：模型组；3：药物干预组。图3　3组大鼠心肌组织中sST2 mRNA的表达

组别nsST2蛋白sST2mRNA对照组100.03±0.020.15±0.01模型组100.28±0.01#0.50±0.04#药物干预组100.15±0.01*0.18±0.01*F2106.387655.005P<0.001<0.001

#:与对照组比较，P<0.05；*：与模型组比较，P<0.05。

3讨论

心肌肥厚一直被认为是长期过负荷作用下的一种适应性改变，但失代偿后可导致扩张性心肌病、心力衰竭和猝死[3-4]。文献[5]报道，高血压合并心肌肥厚使急性心肌梗死、充血性心力衰竭、猝死等心血管事件的发生率增加6～8倍。因此高血压的治疗不仅仅是降压，更重要的是积极逆转心肌肥厚。 最近的研究[6]表明IL-33/ST2通路在心血管系统中发挥重要调节作用,心肌缺血与机械应力作用下ST2的表达均可上调，而ST2L与IL-33结合后可减轻心肌肥厚及心肌纤维化[7]。而且，现已证明心肌梗死及心力衰竭中sST2的表达均显著升高[8-11]。螺内酯作为醛固酮受体拮抗剂的代表性药物，已被证明可以改善心力衰竭患者临床症状及急性心肌梗死患者的生存率[2]。作者通过对IL-33/ST2通路中sST2的研究以了解螺内酯在抑制心肌肥厚方面的作用及可能机制。

肾素-血管紧张素系统中的血管紧张素Ⅱ及交感神经系统中的去甲肾上腺素引起的心肌肥厚主要是通过激活NF-κB,直接引起心肌细胞肥大[12]，醛固酮受体拮抗剂可能是通过细胞外基质代谢产物及炎症介质，调节IL-33/ST2通路中心肌细胞表达产物，参与下游的心脏保护作用[2]，但是螺内酯降低sST2的机制尚不完全清楚，仍需进一步探究。

该研究结果显示药物干预组心脏质量指数、左心室质量指数、心肌细胞直径、sST2蛋白及mRNA表达量均低于模型组，高于对照组。说明醛固酮受体拮抗剂螺内酯可通过降低sST2表达，增强IL-33/ST2L通路的抗心肌肥厚作用，为逆转高血压左室肥厚的药物干预提供了依据。

参考文献

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Effects of spironolactone on soluble ST2 in myocardial tissue of hypertrophy rats

XINGRuixing,ZHAOYulan,HUANGYaping,DONGJing

DepartmentofCardiology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

Key wordsspironolactone；myocardial hypertrophy；soluble ST2；rat

AbstractAim: To study the effects of spironolactone on sST2 of IL-33/ST2 pathway in myocardial hypertrophy rats.Methods: A total of 30 healthy male SD rats were randomly allocated into control group(n=10), model group(n=10) and drug intervention group(n=10).LVM/BM,HM/BM and the size of cardiomyocyte were detected.sST2 mRNA and protein in left ventricular tissue were analyzed by RT-PCR and immunohistochemistry.Results: LVM/BM and HM/BM in the drug intervention group and model group were higher than those in control group(P<0.05).The expression of sST2 in the model group was higher than that in the control group and drug intervention group(P<0.05).Conclusion: Spironolactone could modulate the expression of sST2 in IL-33/ST2 pathway, and alleviate myocardial hypertrophy caused by isoproterenol.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.028

#通信作者，女，1956年2月生，本科，主任医师，研究方向：冠心病、心力衰竭，E-mail:zyl6616@126.com

中图分类号R54