罗　源，王春美，朱相展，盛光耀#

1)郑州大学第一附属医院儿科 郑州 450052　2)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

虎杖苷对K562细胞增殖及凋亡的影响

罗源1)，王春美1)，朱相展2)，盛光耀1)#

1)郑州大学第一附属医院儿科 郑州 4500522)郑州大学生命科学学院 郑州 450001

关键词虎杖苷；K562细胞；Akt/mTOR/p70S6K；凋亡

摘要目的：观察虎杖苷对白血病细胞株K562细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其可能机制。方法：以不同浓度(0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L)虎杖苷处理K562细胞12、24、48 h后，采用CCK-8法检测细胞增殖抑制率。另取对数生长期的K562细胞，分为3组，观察组加入80 μmol/L的虎杖苷，阴性对照组加入DMSO，空白对照组不处理，培养24 h后，采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡，流式细胞仪检测细胞周期，Western blot检测p-Akt、p-mTOR、p70S6K、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平。结果：虎杖苷能有效抑制K562细胞增殖，呈时间和剂量依赖性(P<0.001)。80 μmol/L虎杖苷作用24 h后，K562细胞凋亡率增加(P<0.001)；细胞周期出现G0/G1期至S期的阻滞(P<0.001)；p-Akt、p-mTOR、p70S6K、Bcl-2蛋白表达水平下降(P<0.05)，Bax、Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论：虎杖苷可有效抑制K562细胞增殖并诱导其凋亡，可能是通过抑制Akt/mTOR/p70S6K信号通路及调控相关凋亡蛋白的表达来实现的。

虎杖苷(polydatin,PD)又名白藜芦醇苷，是从蓼科蓼属虎杖(PolygonumCuspidatum)的干根茎中提取的第4种单体，故又名虎杖结晶4号。现代药理学研究[1-2]表明，白藜芦醇及其自然前体虎杖苷在抗血小板聚集及血栓形成、加强心肌细胞收缩和舒张功能、改善休克后重要组织器官的微循环等方面有显著作用。近年研究[3-4]发现，虎杖苷可有效抑制肿瘤细胞增殖并促进其凋亡，但大都是有关实体瘤的研究。该研究拟以人慢性粒细胞白血病细胞株K562为研究对象，观察虎杖苷对K562细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响，并探讨可能的机制。

1材料与方法

1.1材料K562细胞株(购自中国科学院上海细胞研究所，郑州大学医学检验系血液实验室保存)，虎杖苷(美国Sigma公司)，RPMI 1640培养基(美国HyClone公司)，标准胎牛血清(FBS,美国Gibco公司)，DMSO(上海索宝生物科技有限公司)，p-Akt、p-mTOR、p70S6K单克隆抗体(FBS,美国CST公司)，GAPDH、Bcl-2、Bax多克隆抗体、细胞全蛋白提取试剂盒[生工生物工程(上海)有限公司]，Caspase-3多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒(美国BD公司)。虎杖苷溶解于DMSO配制成10 mmol/L贮存液，避光保存于-20 ℃冰箱，待用时用RPMI 1640稀释至相应浓度。

1.2细胞培养K562细胞使用含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素及0.5 mmol/L 2-巯基乙醇的RPMI 1640培养基于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱内培养，1～2 d传代1次，取处于对数生长期的细胞进行以下检测。

1.3细胞增殖检测收集处于对数生长期的K562细胞，调整细胞密度至5×104mL-1，接种于96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液培养过夜，分别加入0、5、10、20、40、80、160、320 μmol/L的虎杖苷溶液10 μL作为实验组，以加入相同体积DMSO K562细胞作为阴性对照，以不含细胞的完全培养基作为空白对照，每组设置3个平行复孔；分别处理12、24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，室温孵育4 h后，用酶标仪于450 nm波长处读取各孔的吸光度(A)值。抑制率=[(A阴性对照孔-A实验孔)/(A阴性对照孔-A空白对照孔)]×100%。实验重复3次。选取最佳时间药物浓度用于后续实验。

1.4细胞凋亡检测取对数生长期的K562细胞，接种于6孔板。分为3组，观察组加入80 μmol/L的虎杖苷溶液，阴性对照组加入等体积的DMSO，空白对照组不处理，每组设3个平行复孔。培养24 h后，离心收集细胞并调整密度为1×106mL-1。取1 mL细胞悬液，用PBS洗2次，分别加入100 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀后，室温避光反应15 min，随后加入500 μL Binding Buffer，1 h内避光上机检测细胞凋亡率。实验重复3次。

1.5细胞周期检测取对数生长期的K562细胞，同1.4中分组处理后，离心收集不同处理组的K562细胞，调整细胞密度为2×105mL-1，取1 mL细胞悬液，PBS清洗1～2遍，加入450 μL PBS重悬细胞，随后加入到1 mL预冷的体积分数70%的乙醇中，4 ℃过夜固定；离心弃去乙醇，PBS清洗1～3遍；加入500 μL 50 mg/L RNase A/PI孵育液，室温避光放置15 min后用流式细胞仪检测细胞周期。实验重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。采用3×7析因设计的方差分析观察不同剂量的虎杖苷作用不同时间对K562细胞增殖的影响；采用单因素方差分析比较3组K562细胞周期、凋亡及相关蛋白表达的差异，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1虎杖苷对K562细胞增殖的影响结果见表1。由表1可见，虎杖苷可有效抑制K562细胞增殖，且呈剂量和时间依赖性。虎杖苷作用24 h的半数抑制浓度(IC50)约为80 μmol/L，因此选择80 μmol/L虎杖苷作用于K562细胞24 h用于后续实验。

表1　虎杖苷对K562细胞的增殖抑制率　%

F时间=187.014，F浓度=726.164，F交互=201.568，P均<0.001。

2.2虎杖苷对K562细胞凋亡的影响Annexin-FITC/PI双染法结果提示：80 μmol/L虎杖苷处理24 h的观察组细胞凋亡率为(14.78±0.30)%， 空白对照组为(2.16±0.44)%，阴性对照组为(2.90±0.60)%，3者相比，差异有统计学意义(F=705.028，P<0.001)；观察组细胞凋亡率高于空白对照组及阴性对照组(P<0.05)。

2.3虎杖苷对K562细胞周期的影响结果见表2。由表2可知，与空白对照组及阴性对照组相比，80 μmol/L虎杖苷处理24 h的观察组出现G0/G1期至S期的阻滞。

表2　虎杖苷对K562细胞周期的影响　%

*：与其他2组相比，P<0.001。

2.4虎杖苷对Akt/mTOR/p70S6K信号通路关键因子及凋亡相关蛋白表达的影响Western blot检测结果见图1、表3。由表3可知，经过80 μmol/L 虎杖苷处理24 h后，K562细胞中p-mTOR、p70S6K、p-AKT表达下调，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，而凋亡蛋白Bax、Caspase-3活性增强。

1:空白对照组;2: 阴性对照组;3:观察组。图1　3组细胞多种蛋白的表达

组别np-mTORp70S6Kp-AKTBcl-2BaxCaspase-3空白对照组30.90±0.080.42±0.100.87±0.050.88±0.030.27±0.040.58±0.05阴性对照组30.89±0.030.46±0.150.85±0.070.86±0.020.26±0.050.60±0.06观察组30.23±0.09*0.08±0.04*0.29±0.03*0.55±0.07*0.44±0.02*0.86±0.05*F85.60611.718133.85258.06018.50327.722P<0.0010.008<0.001<0.0010.0030.001

*：与其他2组相比，P<0.05。

3讨论

虎杖苷是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，这一结合使得白藜芦醇的分子构象发生改变，从而导致生物学特性也发生改变。与白藜芦醇相比，虎杖苷更容易被吸收，更能耐受酶的氧化作用；白藜芦醇不溶于水，而虎杖苷可溶于热水；白藜芦醇通过被动转运进入细胞，而虎杖苷则可利用葡萄糖载体通过主动转运的方式进入细胞内。这些特性的改变有可能使得虎杖苷具有比白藜芦醇更高的生物活性[5]。现代药理学研究[6-8]表明虎杖苷在保护心肌细胞、血管平滑肌细胞，抗血小板聚集，改善微循环等方面有显著作用，此外还能减轻多种因素造成的组织器官损伤，具有保护肝细胞，降血脂及抗脂质过氧化等作用。在抗肿瘤作用方面，虎杖苷对恶性肿瘤细胞包括乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231，肺癌A549、NCI-H1975，宫颈癌HeLa，卵巢癌SKOV-3，肝癌SM7721，鼻咽癌CNE-1，肾细胞癌7860均具有明显的生长抑制作用，且呈剂量和时间-效应关系[3，9-10]。

该研究首先采用CCK-8法检测不同剂量的虎杖苷作用不同时间对K562细胞增殖的抑制作用，结果发现虎杖苷能够有效抑制其增殖，作用呈剂量和时间依赖性，作用24 hIC50为80 μmol/L。用80 μmol/L虎杖苷处理K562细胞24 h后，细胞凋亡率明显升高，细胞周期被阻滞在G0/G1期。

Akt/mTOR/p70S6K通路是PI3K家族介导的重要信号传导通路之一，该通路的激活参与了多种肿瘤细胞的增殖、分化和迁移等的调节，且与肿瘤细胞对化疗药物的耐药性密切相关，故作用于该信号通路各靶点抑制剂的研究逐渐成为人们关注的热点，而mTOR是通路中的关键因子，已证实mTOR靶向抑制剂雷帕霉素对多种肿瘤细胞具有增殖抑制作用[11-14]。该研究结果显示，80 μmol/L虎杖苷处理K562细胞24 h后，该通路中p-mTOR、p-Akt及下游p70S6K表达水平降低，证明虎杖苷对Akt/mTOR/p70S6K通路有抑制作用。

既往研究[15]证明，在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族发挥着重要调控作用。其中，抗凋亡基因bcl-2和促凋亡基因bax是Bcl-2家族中最重要的凋亡相关基因，二者在肿瘤细胞凋亡中发挥着举足轻重的作用。同时，Caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的关键因子，也是凋亡的关键酶和执行者[16]。该研究结果显示，虎杖苷可抑制Bcl-2的表达，并促进Bax及Caspase-3的表达。

综上所述，虎杖苷能够有效抑制K562细胞增殖并促进细胞凋亡，将细胞阻滞在G0/G1期，初步推断虎杖苷能够通过调节Akt/mTOR/p70S6K信号通路发挥作用，该研究结果为阐明虎杖苷防治白血病的作用机制提供了实验依据。

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(2015-08-31收稿责任编辑徐春燕)

Effect of polydatin on cell proliferation and apoptosis of leukemia cell line K562

LUOYuan1)，WANGChunmei1)，ZHUXiangzhan2)，SHENGGuangyao1)

1)DepartmentofPediatrics，theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)SchoolofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

Key wordspolydatin;K562 cell;Akt/mTOR/p70S6K;apoptosis

AbstractAim: To investigate the effect of polydatin on the cell proliferation and apoptosis of leukemia K562 cell line and to study its related molecular mechanism.Methods: Ⅰ:After treatment with different concentrations(0，5，10，20，40，80，160，320 μmol/L) of polydatin for 12, 24, 48 h, the proliferation rate of K562 cells was tested by CCK-8 assay. Ⅱ:K562 cells were allocated into 3 groups,the observation group and negative control group were treated with 80 μmol/L polydatin and DMSO,respectively,and blank control group was not treated.After 24 h, the apoptosis and cell cycle of K562 cells were detected by Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry, respectively. The protein expressions of p-Akt，p-mTOR，p70S6K，Bcl-2，Bax and Caspase-3 were detected by Western blot.Results: The proliferation rate of K562 cells was inhibited by polydatin in a time- and dose-dependent manner(P<0.001). After 24 h treatment with 80 μmol/L polydatin, the apoptosis rate of K562 cells increased(P<0.001),and there was an increase in G0/G1 phase cells and a decrease in S phase cells(P<0.001); polydatin could down-regulate the expressions of p-Akt,p-mTOR,p70S6K,and Bcl-2 and up-regulate the expressions of Bax and Caspase-3(P<0.05).Conclusion: Polydatin could effectively inhibit proliferation and induce apoptosis of K562 cells, which may be via inhibiting the Akt/mTOR/p70S6K signaling pathway and regulating the expressions of apoptosis related proteins.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.027

#通信作者，男,1952年7月生，硕士，教授，研究方向：儿科血液病学，E-mail：shenggy2959@126.com

中图分类号R733.7