崔渊博，马珊珊，张春艳，姚　宁，渠瑞娜，范天黎，关方霞#

1)郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心 郑州 450007　2)郑州大学生命科学学院 郑州 450001　3)郑州大学附属郑州中心医院检验科 郑州 450007　4)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 450001

脂肪源间充质干细胞移植对D-半乳糖衰老模型大鼠肾、肺组织中衰老相关蛋白表达的影响>*

崔渊博1)，马珊珊2)，张春艳3)，姚宁2)，渠瑞娜2)，范天黎4)#，关方霞2)#

1)郑州大学附属郑州中心医院转化医学中心 郑州 4500072)郑州大学生命科学学院 郑州 4500013)郑州大学附属郑州中心医院检验科 郑州 4500074)郑州大学基础医学院药理学教研室 郑州 450001

关键词间充质干细胞移植；衰老模型；衰老相关基因；大鼠

摘要目的：探讨脂肪源间充质干细胞(ADMSCs)静脉移植对D-半乳糖衰老模型大鼠的抗衰老效果。方法：18只SD大鼠随机平均分为3组，模型组与移植组大鼠连续8周腹腔注射D-半乳糖[100 mg/(kg·d)]，对照组腹腔注射生理盐水。然后移植组尾静脉注射ADMSCs(4×106个)，模型组和对照组尾静脉注射生理盐水。4周后，采用Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力，并测定大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性，并用Western blot法检测大鼠肾与肺组织中衰老相关蛋白沉默信息调节因子1(Sitr1)、P16、P21及增殖细胞核抗原(PCNA)的表达。结果：与对照组相比，模型组大鼠空间学习记忆能力降低(P<0.05)；与模型组相比，移植组大鼠空间学习记忆能力明显改善(P<0.05)。与对照组相比，模型组大鼠血清中SOD活性降低，肾与肺组织中Sirt1、PCNA蛋白表达水平降低(P<0.05)，P21、P16蛋白表达水平升高(P<0.05)；与模型组相比，移植组大鼠血清中SOD活性增加(P<0.05)，肾与肺组织中Sirt1、PCNA蛋白表达水平升高(P<0.05)，P21、P16蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论：ADMSCs静脉移植治疗抗衰老作用明显，其可能通过调节衰老相关蛋白表达发挥作用。

衰老作为生物个体一种必然发生的生命现象，是一个动态的、复杂的过程，整体表现为代谢能力下降、适应能力减退等。目前，延缓衰老已成为生命科学及医学领域研究的热点。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有自我更新能力强、分化潜能多向等特点，近年来被越来越多地应用于再生医学领域，其在治疗诸如神经系统损伤疾病、心血管疾病等多种衰老相关疑难杂症方面取得了良好的效果[1-2]。研究发现，应用MSCs移植治疗阿尔茨海默病转基因模型鼠能够促进成体脑部神经再生及改善病理性损害[3]；采用干细胞移植治疗能够显著改善糖尿病、骨质疏松症等衰老相关疾病模型大鼠的症状[4-5]；但治疗机制仍不明确。机体的生理病理过程均受基因的调控，多种基因与衰老的进程关系密切[6]。该研究采用D-半乳糖诱导方法建立大鼠衰老模型，选择具有体外增殖率高、衰老比率较低、获取来源广泛、无伦理学争议等优点的脂肪源间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)进行移植，在行为功能学、生化与分子生物学水平观察了ADMSCs移植的抗衰老效果，并探讨可能的作用机制。

1材料与方法

1.1实验动物、试剂及仪器18只3月龄清洁级健康雄性SD大鼠(体重200～240 g)购自河南省实验动物中心，大鼠ADMSCs由课题组前期分离培养并经过流式细胞术表型鉴定[7]后获得，冻存、复苏并传代后用于实验。细胞DMEM培养基、无噬菌体胎牛血清、胰蛋白酶消化液、碱性成纤维细胞生长因子等购自康为世纪生物公司，超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、ECL发光试剂盒、羊抗兔二抗、β-actin、沉默信息调节因子1(Sitr1)、P16、P21及增殖细胞核抗原(PCNA)兔抗鼠一抗等购自Sigma公司，垂直电泳槽、转膜仪等购自伯乐生物医学产品有限公司。

1.2实验分组18只大鼠随机均分为3组。模型组与移植组腹腔注射D-半乳糖[剂量为100 mg/(kg·d)，连续注射8周[8]]以诱导制备大鼠衰老模型，对照组腹腔注射等量生理盐水。然后取第3代ADMSCs用DMEM培养基制备成2×106mL-1的单细胞悬液。移植组大鼠尾静脉注射单细胞悬液2 mL以进行ADMSCs移植，模型组和对照组大鼠尾静脉注射等量生理盐水。

1.3大鼠空间学习记忆能力的检测ADMSCs移植后4周，采用Morris水迷宫实验检测大鼠空间学习记忆能力。水迷宫分4个象限，直径为200 cm，高度为60 cm；平台直径为18 cm，高度为30 cm，置于水迷宫的第1象限；水迷宫中水面高度以刚没过平台为宜，水温控制在(25±1) ℃。实验前1周为空间适应性练习阶段，大鼠每天在固定时间段内入水进行2～3次练习。适应性练习结束，即开始正式实验。整个水迷宫实验阶段需保持周围环境不变。①空间探索实验：将大鼠依次从水迷宫4个不同象限放入水池，利用采集器采集大鼠运动轨迹，观察并记录穿越平台次数、逃避潜伏期、平台所在象限的停留时间。②反向探索实验：将平台位置对调置于第4象限，实验方法同上，将大鼠依次从水迷宫4个不同象限放入水池，观察并记录上述3个指标。

1.4大鼠血清中SOD活性的测定Morris水迷宫实验后，断颈处死大鼠，采集1.5 mL外周血于洁净的2 mL EP管中，3 500 r/min离心10 min，收集上清于-20 ℃保存备用。按照Sigma公司SOD活性检测试剂盒说明书操作，测定血清中SOD活性。

1.5大鼠肾、肺组织中衰老相关蛋白的检测分离大鼠的肾、肺组织，提取蛋白并测定蛋白浓度。各取200 μg总蛋白并加入上样缓冲液，沸水浴中处理约10 min，冷却至室温后于-20 ℃保存备用。每个蛋白样品依次经SDS-PAGE电泳，转PVDF膜，加β-actin、Sitr1、P16、P21及PCNA抗体杂交，ECL发光检测，胶片晾干后用扫描仪扫描，以目的蛋白与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。以模型组或移植组与对照组蛋白表达水平的比值表示其蛋白相对表达水平。

1.6统计学处理采用SPSS 19.0分析数据。采用单因素方差分析比较3组大鼠空间学习记忆能力、血清中SOD活性,模型组和移植组肾、肺组织中衰老相关蛋白相对表达水平的比较采用两独立样本t检验，检验水准α=0.05。

2结果

2.13组大鼠空间学习记忆能力的比较3组大鼠在实验过程中没有出现死亡，进食正常，无烦躁等情绪波动。与对照组相比，模型组大鼠穿越平台次数减少，逃避潜伏期延长，平台所在象限的停留时间缩短；与模型组相比，移植组大鼠穿越平台次数增加，逃避潜伏期缩短，平台所在象限的停留时间延长(P均<0.05)。见表1。

表1　3组大鼠水迷宫实验结果

*:与对照组比较，P<0.05；#：与模型组比较，P<0.05。

2.23组大鼠血清中SOD活性的比较对照组、模型组和移植组大鼠血清中SOD活性分别为(112.04±7.53)、(79.36±5.28)、(103.72±6.95) U/mL，3组比较差异有统计学意义(F=39.071，P<0.001)。与对照组相比，模型组大鼠血清中SOD活性降低；与模型组相比，移植组大鼠血清中SOD活性明显升高(P<0.05)。

2.3模型组和移植组大鼠肾和肺组织中衰老相关蛋白相对表达水平的比较见图1、表2和表3。与模型组相比，移植组大鼠肾与肺组织中Sirt1、PCNA蛋白的表达升高，P16、P21蛋白的表达降低(P均<0.05)。

图1　3组大鼠肾(上图)和肺(下图)组织中衰老相关蛋白的表达

表2　3组大鼠肾组织中衰老相关蛋白表达水平的比较

表3　3组大鼠肺组织中衰老相关蛋白表达水平的比较

3讨论

细胞衰老作为一种受遗传基因控制的、任何生物体必然发生的生命现象，其过程与发生机制十分复杂。关于细胞衰老的理论有多种，主要包括自由基理论、端粒酶学说、程序化衰老理论、代谢学说等[9-11]，但是，迄今仍然没有一种学说能够完整地阐释衰老发生的机制。

ADMSCs是一种来自于机体的多能干细胞，具有取材广泛、免疫原性低、增殖能力强等特点[12]。因其还具有强大的自我更新能力与多向分化能力等优点，近年来被科研人员应用于糖尿病、骨质疏松症以及帕金森综合征等衰老相关疾病等的治疗，显著的治疗效果与研究进展为将干细胞应用于抗衰老的研究带来了新的契机。

近年来，分子生物学研究[13]发现，一些基因与衰老的发生关系密切，衰老细胞的细胞周期将停滞于G期而不能进入S期。P16与P21基因的激活影响了细胞周期而最终引起细胞衰老。有研究[14]显示，高表达P16可抑制HEK293细胞增殖并将细胞周期阻滞在G0/G1期，促进衰老的发生。Sirt1是一种长寿基因，该基因的缺失将导致机体早衰的发生，其参与了大量与衰老相关的生理病理过程[15]。PCNA在DNA复制和细胞增殖中发挥作用，衰老细胞呈现PCNA低表达现象[16]。

D-半乳糖诱导衰老大鼠模型具有复制方法简便、易操作、稳定性强等优点，可以较好地模拟肝脏、肾脏、肺等脏器损伤，已被广泛应用于研究衰老机制以及延缓衰老药物的筛选等方面。该研究对D-半乳糖衰老模型大鼠通过尾静脉注射移植ADMSCs，结果显示：与对照组比较，模型组大鼠空间学习记忆能力降低，血清中SOD活性降低，肾与肺组织中Sirt1和PCNA表达降低，而P21和P16蛋白表达明显增强，说明模型组大鼠具有衰老表现。与模型组相比，移植组大鼠空间学习记忆能力提高，血清中衰老相关指标SOD活性显著升高，提示移植ADMSCs具有抗衰老作用；与模型组相比，移植组大鼠肾与肺组织中Sirt1、PCNA表达升高，而P16、P21表达降低，提示ADMSCs延缓衰老的机制可能是通过调节细胞周期通路实现的。

总之，该研究结果表明，ADMSCs通过调控衰老相关基因而影响衰老的进程。该研究将为从衰老相关基因角度探索衰老发生的机制及寻求延缓衰老的有效方法提供依据。

参考文献

[1]NARITA T,SUZUKI K.Bone marrow-derived mesenchymal stem cells for the treatment of heart failure[J].Heart Fail Rev,2015,20(1):53

[2]KIM S,CHANG KA,KIM JA,et al.The preventive and therapeutic effects of intravenous human adipose-derived stem cells in Alzheimer's disease mice[J].PLoS One,2012,7(9):e45757

[3]YAN YF,MA T,GONG K,et al.Adipose-derived mesenchymal stem cell transplantation promotes adult neurogenesis in the brains of Alzheimer's disease mice[J].Neural Regen Res,2014,9(8):798

[4]CAO XC,HAN ZB,ZHAO H,et al.Transplantation of mesenchymal stem cells recruits trophic macrophages to induce pancreatic beta cell regeneration in diabetic mice[J].Int J Biochem Cell Biol,2014,53(9):372

[5]YE XH,ZHANG P,XUE SB,et al.Adipose-derived stem cells alleviate osteoporosis by enhancing osteogenesis and inhibiting adipogenesis in a rabbit model[J].Cytotherapy,2014,16(12):1643

[6]ESTEP IP,WARNER JB,BULYK ML.Short-Term calorie restriction in male mice feminizes gene expression and alters key regulators of conserved aging regulatory pathways[J].PLoS One,2009,4(4):42

[7]李东飞，杨春，李桢，等.第4代大鼠脂肪间充质干细胞的免疫表型鉴定[J]．中国组织工程研究与临床康复，2010，14(23)：4207

[8]GU XS,ZHOU Y,HU XW,et al.Reduced numbers of cortical GABA-immunoreactive neurons in the chronic D-galactose treatment model of brain aging[J].Neurosci Lett,2013,549(9):82

[9]MULLER FL,LUSTGARTEN MS,JANG Y,et al.Trends in oxidative aging theories[J].Free Radic Biol Med,2007,43(4):477

[10]LIOCHEV SI.Reactive oxygen species and the free radical theory of aging[J].Free Radic Biol Med,2013,60(9):1

[11]GOLDSMITH TC.Aging,evolvability,and the individual benefit requirement;medical implications of aging theory controversies[J].J Theor Biol,2008,252(4):764

[12]VAN PHAM P.Adipose stem cells in the clinic[J].Biomedical Research and Therapy,2014,1(2):57

[13]崔渊博，马珊珊，姚宁，等．人脐带间充质干细胞移植对老年痴呆小鼠脑、肝组织中衰老相关基因表达的影响[J]．郑州大学学报(医学版)，2015，1(1)：25

[14]马珊珊，刘静，姚宁，等．p16基因高表达对293细胞衰老的影响[J]．郑州大学学报(医学版)，2014，5(5)：622

[15]ANA Q,ALAIN J.Age-associated decrease of SIRT1 expression in rat hippocampus[J].Exp Gerontol,2012,47(2):198

[16]YU SL,KANG MS,KIM HY,et al.The PCNA binding domain of Rad2p plays a role in mutagenesis by modulating the cell cycle in response to DNA damage[J].DNA Repair (Amst),2014,16(7):1

Effects of adipose-derived mesenchymal stem cells transplantation on expression of aging related proteins in kidney and lung tissue of D-galactose induced aging rats

CUIYuanbo1)，MAShanshan2)，ZHANGChunyan3)，YAONing2)，QURuina2)，FANTianli4)，GUANFangxia2)

1)TranslationalMedicineCenter，ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500072)SchoolofLifeSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500013)LaboratoryDepartment,ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity，Zhengzhou4500074)DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001

Key wordsMSCs transplantation;aging model;aging related gene;rat

AbstractAim: To investigate the effects of adipose-derived mesenchymal stem cells(ADMSCs) transplantation on aging in rats.Methods: A total of 18 SD rats were randomly allocated into three groups. The rats in model group and transplantation group were induced by D-galactose for 8 weeks,and control group were only injected with normal saline. And then, the transplantation group was injected with ADMSCs suspension(4×106) by tail venous pathway, the model and control groups were injected with normal saline of the same quantity. Four weeks later,the spatial learning and memory ability of rats were detected by Morris water maze test,the serum activity of SOD was measured, and the expressions of age-related proteins in kidney and lung tissue were detected by Western blot, including silence information regulator 1(Sirt1), proliferating cell nuclear antigen(PCNA), P16 and P21.Results: Compared with control group, spatial learning and memory ability of rats in the model group reduced(P<0.05),while that in transplantation group was improved compared with the model group(P<0.05).Compared with control group, SOD activity in serum of rats in the model group significantly reduced(P<0.05), Sirt1 and PCNA expressions in kidney and lung tissue dramatically decreased(P<0.05),while P16 and P21 expressions increased(P<0.05). Compared with the model group, SOD activity in serum of rats in tranplantation group increased(P<0.05),Sirt1 and PCNA expressions increased(P<0.05),and P16 and P21 expressions decreased(P<0.05).Conclusion: ADMSCs transplantation has obviously anti-aging effect.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.014

#通信作者:范天黎，女，1969年8月生，博士，副教授，研究方向:肿瘤药理及抗肿瘤药物的靶向治疗，E-mail:fantianlipp@163.com;关方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向:干细胞与再生医学，E-mail:guanfangxia@126.com

中图分类号R592

*国家自然科学基金资助项目81471306