马　超，法宪恩，柳　兵，周玉阳，黄真锋，余海彬

郑州大学第二附属医院心血管外科 郑州 450014

低能激光照射对大鼠心肌梗死后miRNA-21表达的影响>*

马超，法宪恩#，柳兵，周玉阳，黄真锋，余海彬

郑州大学第二附属医院心血管外科 郑州 450014

关键词低能激光照射；大鼠；心肌梗死；miRNA-21；心肌保护

摘要目的：观察低能激光照射(LLLI)对大鼠心肌梗死区及其边缘组织中miRNA(简称miR)-21表达的影响。方法：将110只SD大鼠分为假手术组(30只)、对照组(40只)和治疗组(40只)。对照组和治疗组通过结扎左冠状动脉前降支制作心肌梗死模型，假手术组同部位只穿线不结扎，3周后治疗组采用LLLI处理梗死区域，对照组和假手术组照射同一区域但治疗仪不接通电源，各组分别于照射后1 h、24 h、48 h、72 h、7 d取梗死及边缘组织，采用RT-PCR法检测miR-21的表达。结果：梗死中心和边缘区比较，不同组别之间miR-21表达量比较差异有统计学意义(P<0.001)，处理后不同时间miR-21表达量比较差异有统计学意义(P<0.001)；治疗组梗死区miR-21的表达在LLLI处理后各时间点的表达量均高于对照组(P<0.05)；治疗组梗死边缘miR-21的表达量在48 h达到峰值，且不同时间点的表达量均高于对照组和假手术组(P<0.05)。结论：LLLI处理梗死心肌能有效上调梗死及边缘区域miR-21的表达，有较好的心肌保护作用。

低能激光照射(low-level laser irradiation，LLLI)在生命科学领域已有60多年历史[1]，是一项比较成熟的物理疗法。此疗法是使用输出功率为毫瓦级的低能量在未损伤组织的情况下，对靶组织进行调节、活化等生物学刺激，以促进伤口愈合、降低炎症反应、增强线粒体代谢、加速ATP的合成、改善细胞增殖等。近些年，Yang等[2]研究表明LLLI可以增加大鼠心肌梗死后左心室室壁厚度，减少心肌中胶原纤维组织生成，改善心室重塑过程。有学者[1]指出LLLI可以改善梗死区组织微环境，减小心肌梗死面积。该实验使用低能激光处理大鼠心脏梗死区，观察心肌组织中miRNA(简称miR)-21的表达，探讨LLLI处理对心肌组织的保护作用。

1材料与方法

1.1材料成年雌性SD大鼠110只，体重220～250 g，由河南省实验动物中心提供，所有的动物实验均得到郑州大学第二附属医院动物委员会的批准。主要试剂、仪器：生物信号采集与分析系统BL-420S型、小动物呼吸机HX-100E型(成都泰盟科技有限公司)；超声心动图机Sonos 5500型(荷兰Philips公司)；激光治疗仪TY-1型(北京天佑科仪科技有限公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；冷冻离心机2-16K型(德国Sigma公司)；7500 Fast RT-PCR System(美国Applied Biosystems公司)。

1.2实验分组SD大鼠采用随机数字表法分为3组：假手术组(30只)、对照组(40只)、治疗组(40只)。对照组和治疗组通过结扎左冠状动脉前降支制备心肌梗死模型，假手术组同部位穿线但不结扎。

1.3心肌梗死模型制作方法对SD大鼠进行称重，水合氯醛腹腔注射麻醉，剔除颈部和左胸的毛发，切开颈部皮肤，分离皮下组织，行气管切开呼吸机辅助呼吸，在胸骨左缘心尖搏动最强处切开皮肤，钝性逐层分离肌组织，使用眼科剪小心剪开第3～4肋间，开睑器撑开肋间，充分暴露左心耳及周围区域，用纱布压垫肺脏，在心脏表面喷洒0.05 mL体积分数2%利多卡因注射液预防心律失常，使用5-0无损伤缝合线从左心耳下1～2 mm进针，肺动脉圆锥旁出针，结扎后观察左室壁运动减弱、颜色变为白色、心电图ST段抬高才能确定心肌梗死模型制备成功。待心电稳定之后抽出胸腔内气体，逐层关胸，防止漏气，拔出气管插管，挤压大鼠胸部，待呼吸正常后缝合气管及颈部皮肤。注意术后保温，直至大鼠苏醒，抗生素肌内注射3 d，并保证充足的饮食供应[3]。

1.4心肌梗死模型的筛选模型制备3周后，超声心动图检查大鼠心脏，心肌梗死模型的入选标准[4]：①左室射血分数<60%；②左室短轴缩短率<30%；③超声科医生判断有1个或者多个层面出现前壁室壁收缩异常的表现。至少符合上述2项方可入选。

1.5LLLI处理心肌梗死模型建立后3周，对梗死模型进行LLLI处理。开胸方法同上，但此次剪开第5肋间隙，开睑器固定，暴露心脏，在距梗死区心肌表面15 mm处使用二极管激光治疗仪(功率6 mW，波长635 nm)照射，持续时间为125 s，此时心肌所接受的激光能量密度为0.96 J/cm2，3组均进行照射，但假手术组、对照组照射时不接通电源。

1.6心肌梗死区及边缘区miR-21表达的检测各组均在低能激光处理后1 h、24 h、48 h、72 h、7 d腹腔注射麻醉，气管插管，迅速开胸获取心脏，置入4 ℃生理盐水中随心搏排空腔内血液，采集梗死及边缘区域组织，放入-80 ℃冰箱保存。总RNA提取参照Trizol试剂盒说明书进行操作。每一个样本提取1 μg总RNA，逆转录合成cDNA。miR-21引物序列：上游5’-CCTGCCTGAGCACCTCGTGC-3’，下游5’-GACTGTGACGACTACCCCAA-3’，扩增片段大小75 bp；内参U6引物序列：上游5’-CTCGCTTCG GCAGCACA-3’,下游5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’，扩增片段大小109 bp。PCR反应条件：95 ℃ 5 min，然后95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 40个循环，再从60 ℃加热至95 ℃获得相应的融解曲线。反应过程中未加入逆转录酶或cDNA模板者作为阴性对照，每个反应体系设3个复孔。采用2-ΔΔCT法分析miR-21的相对表达量。

1.7统计学处理采用SPSS 19.0进行数据分析，不同组间miR-21相对表达量的比较采用析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2结果

2.1心肌梗死模型制作成功率制备模型后3周，对照组和治疗组共剩69只(86.3%)大鼠，死亡原因有不可恢复的心律失常、术中严重肺脏损伤、心脏破裂、气管分泌物过多、术后心力衰竭等。经过超声筛选，共有53只(66.3%，对照组26只、治疗组27只)符合标准。

2.2梗死区miR-21的表达结果见表1。

表1　处理后不同时间各组大鼠梗死区miR-21相对表达量的比较

F组间=773.200，F时间=160.300，F交互=79.700，P均<0.001；*：与假手术组比较，P<0.05；△：与对照组比较，P<0.05。

2.3梗死边缘区miR-21的表达结果见表2。

表2　处理后不同时间各组大鼠梗死边缘区miR-21相对表达量的比较

F组间=156.600，F时间=16.700，F交互=7.200，P均<0.001；*：与假手术组比较，P<0.05；△：与对照组比较，P<0.05。

3讨论

LLLI主要通过“光生物刺激”对靶组织进行治疗，对靶组织照射并不会产生显著的“热效应”，此疗法安全性高，操作简便，成本低廉，已被临床广泛接受。Yang等[5]发现，低能激光的密度为0.96 J/cm2时能够有效发挥心肌保护作用，减少心肌梗死的面积。该实验中选择距离心脏表面15 mm进行照射，波长635 nm，功率6 mW，持续时间125 s，此时的能量密度为0.96 J/cm2。

多项实验[6]证实miR参与了心肌梗死后的心脏重塑过程，并且miR的表达与非缺血性心肌病、心律失常、动脉粥样硬化、心肌再生都有密切关系，miR很可能被当作新型的生物治疗剂。miR-21是由单个基因编码，位于染色体17q23.2，高度保守[7-8]。起初由于miR-21在多种癌组织中过表达[9]，而被形容为致癌miR。随着研究的深入，miR-21参与心脏结构重塑已引起广泛关注。Kumarswamy等[10]发现在小鼠压力负荷心脏纤维化模型中，miR-21表达的上调可减缓内皮细胞向间质转化，从而部分阻断纤维化的进程。Tu等[11]研究证实，上调miR-21通过PTEN/Akt信号通路抑制细胞凋亡，可以起到心肌保护作用。Liang等[12]揭示了miR-21和TGFβRⅢ在心肌纤维化过程中存在相互抑制关系，而TGFβRⅢ是miR-21特异性靶点。

关于LLLI治疗心肌梗死已经有很多学术成果。如杨继涛等[13]发现LLLI处理梗死的心肌能够显著降低组织中丙二醛的表达量，提高超氧化物歧化酶的活性，有效改善心室重塑过程。Tuby等[14]揭示了LLLI能够提高血管内皮生长因子和诱导型一氧化氮合酶的表达，促进血管再生，改善梗死区微循环，有较好的心肌保护作用。该实验结果显示，对照组在LLLI处理后不同时间，梗死区miR-21表达低于假手术组，边缘区miR-21表达高于假手术组，与Gu等[15]报道相符。治疗组梗死区及边缘区不同时间miR-21的表达均高于对照组，说明LLLI处理梗死及周边区能够上调照射区域内心肌细胞miR-21的表达。

心脏结构重塑是心血管疾病发生的关键过程，可伴随心房颤动、心力衰竭、心肌梗死等疾病[16-18]，miR-21可延缓心肌纤维化，抑制细胞凋亡。LLLI处理梗死区及周边心肌可以安全、高效、特异地上调miR-21的表达，起到心肌保护作用，但调节机制仍需要进一步研究。

参考文献

[1]侯剑峰,袁昕,张浩,等.低能激光照射对梗死后心肌微环境影响的实验研究[J].中国循环杂志,2015,30(1):47

[2]YANG J,HUANG Z,ZHOU Y,et al.Effect of low-level laser irradiation on oxygen free radicals and ventricular remodeling in the infarcted rat heart[J].Photomed Laser Surg,2013,31(9):447

[3]马超,法宪恩,柳兵,等.非呼吸机辅助呼吸下大鼠心梗模型的建立[J].中华实验外科杂志,2015,32(6):1284

[4]付倩,谢明星,王静,等.二维应变超声心动图评价大鼠急性心肌梗死模型局部心肌功能改变的应用价值[J].中华超声影像学杂志,2009,18(12):1071

[5]YANG Z,WU Y,ZHANG H,et al.Low-level laser irradiation alters cardiac cytokine expression following acute myocardial infarction: a potential mechanism for laser therapy[J].Photomed Laser Surg,2011,29(6):391

[6]BIASUCCI LM,CARDILLO MT.MicroRNA and myocardial infarction:a mystery turning into glory？[J].J Am Coll Cardiol,2013,62(11):999

[7]FUJITA S,ITO T,MIZUTANI T,et al.miR-21 gene expression triggered by AP-1 is sustained through a double-negative feedback mechanism[J].J Mol Biol,2008,378(3):492

[8]樊清波,李小威,简立国,等.三七总皂苷对大鼠心肌梗死后血管新生及微小 RNA-21表达的影响[J].郑州大学学报(医学版),2014,49(1):48

[9]阮志敏,武力勇,朱国富,等.microRNA-21与冠心病的相关性研究[J].临床心血管病杂志,2015,31(1):50

[10]KUMARSWAMY R,VOLKMANN I,JAZBUTYTE V,et al.Transforming growth factor-β-induced endothelial-to-mesenchymal transition is partly mediated by microRNA-21[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(2):361

[11]TU Y,WAN L,FAN Y,et al.Ischemic postconditioning-mediated miRNA-21 protects against cardiac ischemia/reperfusion injury via PTEN/Akt pathway[J].PLoS One,2013,8(10):e75872

[12]LIANG H,ZHANG C,BAN T,et al.A novel reciprocal loop between microRNA-21 and TGFβRⅢ is involved in cardiac fibrosis[J].Int J Biochem Cell Biol,2012,44(12):2152

[13]杨继涛,法宪恩,周玉阳,等.低能激光照射对大鼠梗死心肌组织中超氧化物歧化酶和丙二醛的影响[J].中华实验外科杂志,2013,30(4):759

[14]TUBY H,MALTZ L,ORON U.Modulations of VEGF and iNOS in the rat heart by low level laser therapy are associated with cardioprotection and enhanced angiogenesis[J].Lasers Surg Med,2006,38(7):682

[15]GU GL,XU XL,SUN XT,et al.Cardioprotective effect of microRNA-21 in murine myocardial infarction[J].Cardiovasc Ther,2015,33(3):109

[16]蒋伟,法宪恩,李晓召.窦房结细胞裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞的诱导分化作用[J].郑州大学学报(医学版),2011,46(1):79

[17]宋先忠,张华,王俊生,等.冠脉搭桥术同期经心肌注射移植自体骨髓单个核细胞治疗心肌梗死效果观察[J].郑州大学学报(医学版),2011,46(1):131

[18]ZHANG H,HOU JF,SHEN Y,et al.Low level laser irradiation precondition to create friendly milieu of infarcted myocardium and enhance early survival of transplanted bone marrow cells[J].J Cell Mol Med,2010,14(7):1975

Effects of low-level laser irradiation on miRNA-21 expression in rats with myocardial infarction

MAChao,FAXian′en,LIUBing,ZHOUYuyang,HUANGZhenfeng,YUHaibin

DepartmentofCardiovascularSurgery,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

Key wordslow-level laser irradiation;rat;myocardial infarction;miRNA-21;cardioprotection

AbstractAim: To observe the effects of low-level laser irradiation(LLLI) on miRNA(miR)-21 expression in myocardial infarct area and the edge tissue.Methods: A total of 110 SD rats were randomly allocated into sham operation group(30 rats), control group(40 rats), and the treatment group(40 rats).Myocardial infarction model in control and treatment groups was made by ligation of the left anterior descending coronary artery.After three weeks the treatment group was given LLLI, the control group and the sham operation group was irradiated at the same site but the device did not power on.At 1 h, 24 h, 48 h, 72 h, 7 d after irradiation, miR-21 expression was detected using RT-PCR.Results: miR-21 expression was significantly different between different groups and between the center and edge of the infarct area(P<0.001), miR-21 expression at different time points after treatment also had significant difference(P<0.001). The expression of miR-21 in the treatment group was higher than that in the control group at each time point after LLLI treatment(P<0.05), miR-21 expression level peaked at 48 h at the edge of the infarct area in treatment group,and the expression level at different time points was higher than control group and the sham operation group(P<0.05).Conclusion: LLLI treatment could increase the miR-21 expression in core and edge of infarct area, and has better myocardial protection function.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.012

#通信作者，男，1962年8月生，博士，教授，主任医师，研究方向：心血管疾病的基础与临床，E-mail：mcatsqsdfive@163.com

中图分类号R654.2

*国家自然科学基金资助项目81241003；河南省卫生科技创新型人才工程卫生科技领军人才资助项目；河南省教育厅科学技术研究重点项

目资助计划资助项目12A320026；河南省科技创新杰出人才计划资助项目104200510007；郑州市科技创新人才培育计划领军人才资助项目

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