徐小艳，王晓卫，阙菡雅，王　娜，夏艳秋，薛　腾，燕　贞，周　舫#

1)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 450001　2)周口职业技术学院卫生保健教研室 周口 466000　3)郑州市疾病预防控制中心公共卫生科 郑州 450000

沉默NOX1表达对A549细胞增殖的影响>*

徐小艳1)，王晓卫2)，阙菡雅3)，王娜1)，夏艳秋1)，薛腾1)，燕贞1)，周舫1)#

1)郑州大学公共卫生学院劳动卫生学教研室 郑州 4500012)周口职业技术学院卫生保健教研室 周口 4660003)郑州市疾病预防控制中心公共卫生科 郑州 450000

关键词A549细胞;ROS;NOX1;凋亡

摘要目的：探讨NOX1对肺癌A549细胞凋亡和增殖的影响。方法：通过瞬时转染技术转染特异性的NOX1小干扰RNA(siRNA)，按转染情况分为Mock组、NC组、FAM-NC-NOX1 siRNA组，转染12 h后采用Western blot检测NOX1蛋白的表达，通过荧光探针DCFH-DA检测细胞ROS水平,流式细胞仪检测细胞增殖活性和凋亡率。结果：siRNA转染12 h以上，转染率稳定在80%以上，NOX1蛋白的表达量与Mock组相比下降(P<0.05)；与Mock组相比， FAM-NC-NOX1 siRNA组细胞在24、36、48 h的增殖活性均下降，ROS水平也下降(P<0.05)。结论：NOX1 siRNA转染A549细胞能有效抑制细胞的增殖。

国际癌症研究中心报告[1]显示：世界范围内发病率和病死率最高的癌症依然是肺癌，仅仅2012年全球新增肺癌患者约180万，约159万人死亡，中国所占的比例为1/3以上。肿瘤发生时，机体发生一系列的改变，肿瘤细胞的生长均需要活性氧(reactive oxygen species,ROS)的参与[2]，一些肿瘤的治疗手段也是通过改变ROS水平来达到治疗目的[3]。NADPH氧化酶NOX家族是ROS的主要来源[4-5]。肺组织中NOX家族成员有不同程度的表达，其中NOX1的表达量在肺癌组织中高于正常组织[6]。A549细胞为人肺腺癌细胞,可以以稳定的形式传代培养[7-8]，因此选取A549细胞用于该研究，通过观察NOX1在A549细胞增殖与凋亡中的作用，为肺癌的治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料A549细胞购自中科院上海细胞生物研究所，NOX1小干扰RNA(siRNA)为上海吉玛制药有限公司提供，Sunriseremote酶标仪购于奥地利TECAN公司，DYCZ-24DN电泳仪购于北京市六一仪器厂，流式细胞仪购于美国BD公司，细胞凋亡检测试剂盒购于德国美天妮公司，无支原体胎牛血清购于美国Gemini公司，RPMI 1640培养基购于北京索莱宝科技有限公司。所使用的siRNA核苷酸序列见表1。

表1　siRNA核苷酸序列

1.2NOX1 siRNA的转染选取生长状态良好的细胞进行NOX1 siRNA的转染，转染前24 h将细胞密度调整到0.8×105～1.0×105mL-1后接种至6孔板，每孔加2 mL 细胞悬液，采用Lipofectamine2000转染试剂转染NOX1 siRNA至A549细胞中。设置Mock组、NC组和FAM-NC-NOX1 siRNA组，其中Mock组只加转染试剂，NC组转染NC-NOX1 siRNA，FAM-NC-NOX1 siRNA组转染FAM-NC-NOX1 siRNA。严格按照说明书转染步骤操作。重复测定3次，确定转染条件使其转染率能稳定在80%以上。

1.3Western blot检测NOX1蛋白的表达转染24 h后，提取各组总蛋白，调整上样量为每组25 μg，按比例稀释蛋白样品和上样缓冲液后95 ℃ 5 min。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后用50 g/L脱脂奶液37 ℃封闭2 h，TBST洗3次，每次10 min，一抗过夜后TBST洗3次，然后加二抗37 ℃孵育2 h，再次TBST洗3次后，加入适量ECL发光液，用Image600进行曝光、测定。实验重复3次。

1.4细胞增殖活性测定调整A549细胞密度至5×104mL-1，接种至96孔板，每组5个复孔，每孔加细胞悬液200 μL，放入CO2恒温培养箱中培养。转染后12、24、36、48 h,加入20 μL稀释好的MTT 溶液，CO2恒温培养箱中继续孵育4 h，小心吸去上清液，每孔加150 μL的DMSO，匀速摇晃10 min，用酶标仪检测492 nm处各孔吸光度值。

1.5DCFH-DA法检测细胞内ROS水平利用荧光探针DCFH-DA进行A549细胞ROS的检测。调整细胞密度为1.0×105mL-1，按照实验分组将A549细胞培养于6孔板中，转染48 h后，按DCFH-DA终浓度为10 μmol/L加样；把细胞清洗并消化后，用稀释好的探针重悬细胞，置于37 ℃细胞培养箱中孵育30 min，每隔3～5 min颠倒混匀一次，使探针与细胞充分接触；用PBS洗涤细胞3次，以除去未进入细胞的DCFH-DA；用0.5 mL 的PBS重悬细胞，用流式细胞仪488 nm激发波长、525 nm发射波长，FL1收集DCF的荧光信号,根据收集的荧光信号所在的峰位置及大小表示ROS表达的水平。实验重复3次。

1.6流式细胞仪检测细胞凋亡率各组细胞转染48 h后，将细胞消化，加入Binding Buffer 1 mL，1 000 r/min离心,重复1次。加入Binding Buffer 100 μL吹打混匀,加入10 μL Annexin V-FITC避光混匀后放置15 min。用500 μL Binding Buffer重悬细胞后加入5 μL PI，立即上流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。实验重复3次。

1.7统计学处理采用SPSS 21.0对数据进行统计学分析。不同组间NOX1相对表达量和ROS水平以及凋亡率的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1A549细胞转染NOX1 siRNA的转染率转染12 h后，在荧光显微镜下观察转染FAM-NC-NOX1 siRNA的A549细胞，结果见图1。

A：Mock组；B：NC组；C：FAM-NC-NOX1 siRNA组。图1　瞬时转染12 h后荧光显微镜下的A549细胞(×200)

2.2抑制NOX1表达后A549细胞增殖活性的改变结果见图2。

-◆-:Mock组；-■-：NC组；-▲-：FAM-NC-NOX1 siRNA组。图2　转染后不同时间各组细胞的吸光度值

2.3不同处理组A549细胞ROS水平、NOX1相对表达量及凋亡率的比较结果显示，FAM-NC-NOX1 siRNA组NOX1蛋白表达低于Mock组和NC组；与Mock组和NC组相比， FAM-NC-NOX1 siRNA组ROS水平下降；3组之间凋亡率比较，差异无统计学意义。见图3、表2。

1：Mock组；2：NC组；3：FAM-NC-NOX1 siRNA组。图3　Western blot检测各组A549细胞NOX1蛋白的表达

组别ROS水平NOX1相对表达量凋亡率/%Mock组524.00±31.651.00±0.023.57±0.26NC组472.33±29.860.92±0.052.90±0.17FAM-NC-NOX1siRNA组180.16±25.60*0.28±0.03*3.90±0.35F48.089350.9523.756P<0.001<0.0010.110

*：与Mock组和NC组相比，P<0.05。

3讨论

随着人们生活水平的提高，环境污染的加剧，生活压力的加大，肿瘤的发病率也在上升，其中肺癌尤为明显。研究[2,9-11]表明，肺癌的发生发展过程与ROS有着密切的联系，且目前已经明确的化学致癌物、电离和紫外辐射均能使细胞内的ROS水平升高，许多原发性肿瘤和细胞系的ROS水平均高于正常组织的表达水平。

研究[12]表明，NOX1和肿瘤的发生密切相关。Suh等[13]首次将NOX1质粒转染至无胸腺的小鼠后小鼠表皮形成了肿瘤，这就表明其具有促进肿瘤生成的可能，所以该实验选择观察NOX1抑制对A549细胞凋亡和增殖的影响。结果显示，细胞转染率稳定在80%以上，说明NOX1 siRNA成功导入到了A549细胞中；另外，FAM-NC-NOX1 siRNA组NOX1蛋白的表达水平明显下降，说明实验选取的NOX1干扰序列沉默效果良好，可以有效抑制NOX1的表达。

NOX1 siRNA成功抑制A549细胞NOX1的表达后，用MTT法检测细胞的增殖活性，发现NOX1被抑制24、36、48 h后细胞的增殖活性均下降，但是在12 h时增殖活性并无变化，说明在24 h后才能抑制A549细胞的增殖活性，所以之后的实验中选择了NOX1 siRNA转染24 h后观察细胞。ROS在肺部肿瘤的各个阶段均发挥作用，在肿瘤的形成阶段，ROS可能激活了原癌基因如c-Jun和c-Fos,而c-Jun的过表达与肺癌有着直接的关系[14]。为了观察NOX是否通过产生ROS来影响A549细胞的增殖活性，作者选用DCFH-DA法检测ROS水平，从结果可以看出ROS水平和细胞增殖活性的变化趋势是一致的，说明NOX1可能通过调节ROS水平来调节A549细胞的增殖活性。

为了探讨NOX1抑制对A549细胞凋亡的影响，作者采用流式细胞仪来检测细胞凋亡率，从结果可以看出，细胞的凋亡并未发生变化。一般来说，细胞增殖活性的降低伴随着凋亡的升高，但是该结果显示NOX1表达量及ROS水平的下降使细胞增殖活性下降，但并未能促进A549细胞凋亡率的增加。这可能是由于ROS水平下降后，使其细胞周期受到阻滞，从而导致其增殖活性的下降，而降低后的ROS水平仍足以支持A549细胞的存活，且在A549细胞中NOX家族的其他成员均有表达，可能其之间存在交互作用，共同调控细胞的凋亡通路。

综上所述，NOX1 siRNA可以有效抑制NOX1的表达，NOX1表达受抑制后，随着A549细胞中ROS水平的下降，细胞的增殖活性也下降，但是细胞凋亡水平未发生改变，其机制尚未明确，需要进一步研究证实。

参考文献

[1]International Agency for Research on Cancer.World cancer report 2014[R].Geneva:WHO,2014.

[2]JOHNSON B,CHANDRA J.EGFR-initated NADPH oxidase activity regulates Fyn expression in glioblastoma multiforme[J].Cancer Res,2014,74(19):511

[3]LU JM,RISBOOD P,KANE CT,et al.Development of potent NADPH oxidase inhibitors with significant activity against colon cancer[J].Cancer Res,2014,74(19):4750

[4]EL-NAGA RN.Pre-treatment with cardamonin protects against cisplatin-induced nephrotoxicity in rats: impact on NOX-1, inflammation and apoptosis[J].Toxicol Appl Pharmacol,2014,274(1):87

[5]BROWN DI,GRIENDLING KK.Nox proteins in signal transduction[J].Free Radic Biol Med,2009,47(9):1239

[6]JUHASZ A,GE Y,MARKEL S,et al.Expression of NADPH oxidase homologues and accessory genes in human cancer cell lines, tumours and adjacent normal tissues[J].Free Radic Res,2009,43(6):523

[7]王小龙,冯斐斐,孙鹏辉,等.HSP70、JNK和p38在放线菌素D诱导的A549细胞凋亡中的作用[J].郑州大学学报(医学版),2014,49(5):668

[8]阙菡雅,王小龙,李杰,等.沉默热休克蛋白70基因对 A549细胞凋亡的影响[J].郑州大学学报(医学版),2015,50(5):641

[9]ROY K,WU Y,MEITZLER JL,et al.NADPH oxidases and cancer[J].Clin Sci (Lond),2015,128(12):863

[10]BAUER G,ZARKOVIC N.Revealing mechanisms of selective, concentration-dependent potentials of 4-hydroxy-2-nonenal to induce apoptosis in cancer cells through inactivation of membrane-associated catalase[J].Free Radic Biol Med,2015,81:128

[11]WU YZ,DOROSHOW JH.IL-4/IL-13 induce Duox2/DuoxA2 expression and reactive oxygen production in human pancreatic and colon cancer cells[J].Cancer Res,2014,74(19):5358

[12]LIU X,PEI C,YAN S,et al.NADPH oxidase 1-dependent ROS is crucial for TLR4 signaling to promote tumor metastasis of non-small cell lung cancer[J].Tumour Biol,2015,36(3):1493

[13]SUH YA,ARNOLD RS,LASSEGUE B,et al.Cell transformation by the superoxide-generating oxidase Mox1[J].Nature,1999,401(6748):79

[14]VAN DEN BERG MC,VAN GOGH IJ,SMITS AM,et al.The small GTPase RALA controls c-Jun N-terminal kinase-mediated FOXO activation by regulation of a JIP1 scaffold complex[J].J Biol Chem,2013,288(30):21729

Effect of silencing NOX1 on proliferation of A549 cells

XUXiaoyan1),WANGXiaowei2),QUEHanya3),WANGNa1),XIAYanqiu1),XUETeng1),YANZhen1),ZHOUFang1)

1)DepartmentofOccupationalHealth,CollegeofPublicHealth,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou4500012)DepartmentofHygiene,ZhoukouVocationalandTechnicalCollege,Zhoukou4660003)DepartmentofPublicHealth,CenterforDiseasePreventionandControlofZhengzhou,Zhengzhou450000

Key wordsA549 cell;ROS;NOX1;apoptosis

AbstractAim: To explore the proliferation and apoptosis in A549 cells after down-regulating NOX1 expression.Methods: NOX1 interference in A549 cells was achieved by NOX1 small interference RNA(siRNA). A549 cells were allocated into Mock group, NC group, and FAM-NC-NOX1 siRNA group. Being transfected specifically through the transient transfection technology about 12 h,the expression of NOX1 protein was detected by Western blot,then the fluorescent probe DCFH-DA was used to detect the ROS levels of cells,the flow cytometry was used to detect the changes of cell proliferation activity and apoptosis.Results: The transfection efficiency of NOX1 siRNA was above 80% in A549 cells. Compared with the Mock group,NOX1 protein expression was decreased, the cell viability was decreased at 24, 36, 48 h after transfection,and the ROS level in FAM-NC-NOX1 siRNA group was decreased(P<0.05).Conclusion: NOX siRNA transfection could effectively inhibit the proliferation of A549 cells.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.011

#通信作者，女，1974年7月生，博士，教授，研究方向：职业肿瘤和应激医学，E-mail：zhoufang23@sina.com

中图分类号R730.1

*河南省高等学校重点科研项目16A330008