贾莉婷，张玉超，李　静，张琳琳，田　远，于海洋，荣守华，邢金芳，李君芳，马啸天

郑州大学第三附属医院检验科 郑州 450052

miR-200c对三阴性乳腺癌细胞系上皮间质转化的影响>*

贾莉婷△，张玉超，李静，张琳琳，田远，于海洋，荣守华，邢金芳，李君芳，马啸天

郑州大学第三附属医院检验科 郑州 450052

△女，1958年11月生，本科，教授，研究方向：临床免疫学，E-mail：jialt@163.com

关键词三阴性乳腺癌；miR-200c；Slug；E-cadherin；上皮间质转化

摘要目的：探讨miR-200c对三阴性乳腺癌细胞系上皮间质转化的影响。方法：选取三阴性人乳腺癌细胞系BT549、MDA-MB-231和非三阴性人乳腺癌细胞系MCF-7、SK-BR-3为研究对象，各细胞系按转染情况分为A组(miR-200c模拟物/Lipo2000组)、B组(miR-200c阴性对照物/Lipo2000组)、C组(miR阴性对照物/Lipo2000组)、D组(Lipo2000组)、E组(空白对照组)。分别提取各组细胞的总RNA和蛋白，通过RT-PCR检测Slug和E-cadherin mRNA表达水平，通过Western blot检测Slug和E-cadherin蛋白表达水平。采用划痕实验检测BT549和MDA-MB-231的迁移能力。结果：三阴性细胞系与非三阴性细胞系相比，E组Slug、E-cadherin在mRNA与蛋白水平的表达量，差异有统计学意义(P<0.05)。转染miR-200c后，三阴性细胞系BT549、MDA-MB-231 Slug在mRNA和蛋白水平表达量均降低(P<0.05)，E-cadherin在mRNA和蛋白水平表达量均增高(P<0.05)，细胞迁移能力下降(P<0.05)。结论：miR-200c可通过下调三阴性乳腺癌细胞系Slug的表达，进而抑制上皮间质转化，降低细胞迁移能力。

三阴性乳腺癌发病年龄早、预后差、极易发生侵袭转移。上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。E-cadherin丢失是EMT的最主要特征，对预测乳腺癌转移具有较高特异性[1-3]，它的表达受转录因子Slug的靶向调控。miR-200c在调节乳腺癌浸润、侵袭、转移中发挥重要作用，是目前研究乳腺癌EMT的热点[4-6]。迄今，仅有作者所在的课题组[7]对三阴性细胞系BT549 转染miR-200c用于研究Slug调控EMT机制的报道，由于乳腺癌是一种高度异质性疾病，在其他细胞系中miR-200c是否通过上述途径调控EMT尚未见报道。该研究选用三阴性细胞系和非三阴性细胞系，观察转染miR-200c模拟物后不同细胞系Slug和E-cadherin在mRNA、蛋白水平的表达及对细胞迁移能力的影响，探讨miR-200c对三阴性乳腺癌EMT的调节作用，以期为临床诊治三阴性乳腺癌提供新的靶标。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系BT549 由郑州大学第三附属医院科研中心保存，MDA-MB-231由郑州大学第一附属医院小儿外科实验室赠送，MCF-7和SK-BR-3由河南科技大学第一附属医院肿瘤表观遗传实验室赠送。各株细胞特征及分离来源见表1。

表1　4株人乳腺癌细胞系的生物学特征

*：源自www.microrna.org。

1.1.2主要试剂和仪器Slug、E-cadherin、GAPDH基因上下游引物和miR-200c模拟物由广州锐博公司设计和合成，miR阴性对照物购自美国Abcam公司，转染试剂Lipo2000购自美国Invitrogen公司，兔抗人Slug一抗购自美国Santa Cruz公司，兔抗人E-cadherin一抗购自美国Abcam公司，mRNA逆转录试剂、鼠抗人β-actin一抗、羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗均购自北京鼎国公司。逆转录仪器和扩增仪器均为美国Life公司产品，CLX Odyssey扫描仪为美国Li-Cor公司产品。

1.2细胞培养所有细胞均用含双抗(青霉素、链霉素)和体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中培养。

1.3细胞转染和分组待细胞处于对数生长期时用胰蛋白酶消化细胞，将细胞分别按每孔1×105个或3×105个细胞接种于6孔板后进行培养，待细胞融合度达75%左右，参照Lipo2000说明书，按转染物不同分为：miR-200c模拟物/Lipo2000组(A组)、miR-200c阴性对照物/Lipo2000组(B组，目的是针对性地排除miR-200c模拟物分子片段对细胞的影响)、miR阴性对照物/Lipo2000组(C组，目的是作为阴性对照)，终浓度均为50 nmol/L，同时设置转染等量Lipo2000的试剂对照组(D组)和不做任何处理的空白对照组(E组)。

1.4各组细胞中Slug和E-cadherin mRNA表达的RT-PCR检测待细胞融合度达90%以上，按照Trizol试剂说明书提取细胞总RNA，根据逆转录试剂盒说明书将其逆转录为cDNA后进行RT-PCR。RT-PCR体系为20 μL，Slug、E-cadherin和GAPDH引物序列同之前研究[7]。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法对目标因子进行相对定量分析，设E组Slug和E-cadherin mRNA的表达量为1。实验重复3次。

1.6三阴性细胞迁移能力的划痕实验检测将BT549和MDA-MB-231按每孔1×105个细胞的密度均匀接种于6孔板，培养24 h后更换为不含抗体培养基，用Lipo2000对细胞进行转染。12 h后，用高压灭菌的枪头对各组细胞划平行直线，无菌PBS清洗2遍后，用2 mL完全培养基继续培养。分别于0、12、24、36 h观察各组细胞3个视野的划痕宽度，通过Image Pro Plus 6.0计算划痕宽度。划痕宽度恢复率=(0 h划痕宽度-36 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%，以划痕宽度恢复率表示细胞迁移能力强弱。

1.7统计学处理应用SPSS 19.0进行统计学分析。各组间Slug、E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量及划痕宽度恢复率的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2结果

2.1E组Slug、E-cadherin的mRNA和蛋白表达量各株细胞系Slug、E-cadherin的基础表达量见图1、表2。

2.2miR-200c对不同细胞系Slug、E-cadherin表达的影响各组细胞中Slug和E-cadherin的表达量见表3、4，其中三阴性细胞系的Slug蛋白表达情况见图2。

1:MCF-7;2:BT549;3:SK-BR-3;4:MDA-MB-231。图1　E组Slug、E-cadherin的蛋白表达情况

细胞系SlugmRNA蛋白E-cadherinmRNA蛋白BT5491.00±0.01*11.09±0.94*1.00±0.01#1.57±0.40*MDA-MB-2310.78±0.08*12.27±2.15*0.93±0.06#2.37±0.47*MCF-70.41±0.110.38±0.031.35±0.0749.43±3.60#SK-BR-30.19±0.080.42±0.101.80±0.5329.27±3.42F65.65292.7216.570255.640P<0.001<0.0010.015<0.001

*：与MCF-7、SK-BR-3比较，P<0.05；#：与SK-BR-3比较，P<0.05。

表3　miR-200c对不同细胞系 Slug和E-cadherin mRNA表达水平的影响(n=3)

*：与B组、C组、D组、E组相比，P<0.05。

表4　miR-200c对不同细胞系Slug和E-cadherin蛋白表达水平的影响(n=3)

*：与B组、C组、D组、E组相比，P<0.05。

图2　miR-200c对三阴性细胞系Slug蛋白表达的影响

2.3miR-200c对三阴性乳腺癌细胞迁移能力的影响三阴性细胞系0、12、24、36 h的划痕宽度恢复率见图3，其中36 h的划痕宽度恢复率见表5。

左：BT549；右：MDA-MB-231。图3　不同时间点三阴性细胞系划痕宽度恢复率

%

*：与B组、C组、D组、E组相比，P<0.05。

3讨论

目前多数研究[8-10]报道EMT及其调控因子是治疗三阴性乳腺癌的主要靶标。Liu等[11]发现在复发率高、易转移的患者中，Slug高表达和E-cadherin低表达的比例均为63.4%；Adhikary等[12]发现通过抑制Slug的表达或E-cadherin的降解，可上调E-cadherin的表达，有效抑制EMT。该研究结果显示，三阴性细胞系基础表达量与非三阴性细胞系相比，Slug高表达、E-cadherin低表达，与文献[11-13]报道一致，表明Slug、E-cadherin的表达高低与三阴性癌细胞的易转移性直接相关。

前期该课题组[7]仅对三阴性细胞系BT549进行研究，发现转染miR-200c模拟物之后其Slug mRNA和蛋白表达量均下降，E-cadherin mRNA表达量上升，且该组细胞侵袭、迁移能力均被抑制。该研究在BT549基础上，增加了三阴性细胞系MDA-MB-231及两株非三阴性细胞系MCF-7、SK-BR-3为研究对象，对不同细胞系转染miR-200模拟物，结果表明与非三阴性细胞系相比，两株三阴性细胞的Slug mRNA与蛋白表达均明显降低，E-cadherin mRNA与蛋白表达则明显升高。已有研究[3-4]发现，Slug可通过结合E-cadherin基因启动子的E盒而直接抑制其表达，进而发挥对EMT的抑制作用。由此推测，miR-200c在三阴性细胞系中可通过抑制Slug的表达而促进E-cadherin的表达，最终抑制EMT进程。结合文献[14]可推测：Slug mRNA和蛋白高表达是miR-200c发挥抑制作用的前提条件之一。

三阴性乳腺癌细胞系E-cadherin低表达，细胞与细胞间黏附能力低，癌细胞迁移能力较强。该研究采用划痕实验观察三阴性乳腺癌细胞系转染miR-200c后迁移能力的变化，结果显示：A组的划痕宽度恢复率低于其他组，表明miR-200c可以降低细胞迁移能力。结合Slug、E-cadherin在mRNA和蛋白水平的表达情况，推测在三阴性细胞系中存在可调节EMT进程的miR-200c/Slug/E-cadherin途径。

综上所述，在三阴性细胞系中，miR-200c可通过下调Slug的表达而提高E-cadherin的表达，进而抑制癌细胞EMT，降低乳腺癌细胞的迁移能力。Slug作为miR-200c/Slug/E-cadherin调节途径的重要环节，有望成为三阴性乳腺癌个体化治疗的靶点之一。

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Effects of miR-200c on epithelial-mesenchymal transition of triple negative breast cancer cell lines

JIALiting,ZHANGYuchao,LIJing,ZHANGLinlin,TIANYuan,YUHaiyang,RONGShouhua,XINGJinfang,LIJunfang,MAXiaotian

ClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

Key wordstriple negative breast cancer;miR-200c;Slug;E-cadherin;epithelial-mensenchymal transition

AbstractAim: To investigate the role of miR-200c in the epithelial-mesenchymal transition(EMT) of triple negative breast cancer(TNBC). Methods: Human breast cancer lines TNBC cells(BT549 and MDA-MB-231), and non-TNBC cells(MCF-7 and SK-BR-3) were chosen in this study. Each cell line was transient transfected with miR-200c mimic and Lipo2000(group A), miR-200c-control and Lipo2000(group B), miR-negative control and Lipo2000(group C),reagent control(group D) and blank control(group E). Then total RNA and protein were extracted and determined by RT-RCR and Western blot, respectively. Wound healing assay was applied to determine the migratory ability of each group in BT549 and MDA-MB-231. Results: Compared with non-TNBC cells,the expression levels of Slug mRNA and protein were significantly increased,while those of E-cadherin mRNA and protein were decreased(P<0.05). In TNBC cells BT549 and MDA-MB-231, the cells transfected with miR-200c showed significant down-regulation of Slug(P<0.05), up-regulation of E-cadherin(P<0.05), and cell migratory ability was significantly decreased(P<0.05). Conclusion: miR-200c might inhibit the EMT and decrease the migratory ability of TNBC cell lines by down-regulating the expression of Slug.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.010

中图分类号R392.1

*河南省科技厅创新团队项目20140629